ERBB4通過靶向調控miR-193a-3p調節TP53INP1的表達

李明如，聶振凱，林貴湖，張凱華

中國航天科工集團七三一醫院胸外科，北京100074

肺腺癌是最常見的肺癌類型，也是最致命和最常見的癌癥之一[1]。肺腺癌患者的5 年總生存率僅為11%，嚴重威脅著人類健康[2]。因此，闡明肺腺癌發生的分子機制，尋找新的預后標志物和分子治療靶點，提高對人肺腺癌的診斷、預防和治療水平，已成為當務之急。ERBB4 是表皮生長因子受體家族成員，在生理和病理過程中起重要作用。但ERBB4 在癌癥中的作用仍存在爭議。長期以來，ERBB4 一直被認為是一種致癌基因，如是黑色素瘤的潛在治療靶點[3]，促進尤文氏肉瘤的轉移[4]和人乳腺癌細胞的增長[5-6]，甚至可以提高肺癌細胞的增殖潛能[7]。然而，一些研究結果卻表明ERBB4 在腫瘤中發揮著抑癌的作用，如促進乳腺癌細胞周期阻滯和凋亡[8-9]，ERBB4 缺失會促進肝細胞腫瘤的發生[10]。最近有研究發現ERBB4 的缺失通過抑制腫瘤抑制因子TP53 誘導核蛋白 1（TP53- inducible nucleoprotein 1，TP53INP1）的表達來抑制p53 基因的表達，從而促進了肝癌的發生發展[10]。本研究旨在探究ERBB4與TP53INP1 在肺腺癌中的表達作用關系，并揭示ERBB4 的表達對肺腺癌預后的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

20 例腫瘤組織樣本來自在中國航天科工集團七三一醫院治療的肺腺癌患者；肺腺癌細胞系SPC-A-1、H1299 和人正常肺上皮細胞BEAS-2B購自中國科學院細胞庫，均采用RPMI-1640 培養基（添加10%胎牛血清），于37℃、含5% CO2濕化氣氛的培養箱中生長；pGL3 載體購自上?？道噬锟萍加邢薰?；RPMI-1640 培養基、胎牛血清購自Gibco 公司；LipofectAMINE 3000 試劑盒、TRIzol試劑購自Invitrogen 公司；逆轉錄試劑盒購自大連TaKaRa 公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑購自Promega 公司；TP53INP1、ERBB4、β-actin 及含辣根過氧化物酶的二抗購自Abcam 公司；化學發光成像系統購自BioRad 公司。

1.2 細胞轉染及過表達載體構建

用LipofectAMINE 3000 試劑盒對H1299 細胞中的ERBB4 轉染siRNAs，分為si-ERBB4 組和si-NC 組。將PCR 擴增得到的ERBB4 基因克隆到慢病毒載體中，滴度檢測后，將成功包裝的過表達載體和陰性對照載體轉染肺腺癌細胞H1299，分為oe-ERBB4 組和oe-NC 組。

1.3 數據生物信息學分析

通過Kaplan-Meier plotter 分析平臺（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service），在線分析來自TCGA 數據庫的TP53INP1 和ERBB4 基因表達數據與肺腺癌生存預后的關系。

1.4 RNA 提取和qRT-PCR

用TRIzol 試劑提取總RNA，用逆轉錄試劑盒反轉cDNA，采用SYBR 熒光染料進行qRT-PCR。標準化為β-actin mRNA 的表達。TP53INP1 正義引物為5′-GCCTAAAGGCTACGGACTATTGC-3′，反義引物為5′-GGACCTAATCGAATGCTATTCAGA-3′；ERBB4 正義引物為5′-GTTGGCAGTCCAGCTA TGCAATAC-3′，反義引物為5′-CTATACGATACCTCCAACTAGGA-3′。實時定量PCR 反應一式3份?；虮磉_的相對水平采用2-ΔΔCt法計算。

1.5 Western 印跡分析

將熱變性的蛋白樣品點至SDS-PAGE 膠中，電泳結束后濕轉到PVDF 膜，用5%脫脂牛奶封閉，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST 洗滌后，與標記有辣根過氧化物酶的二抗孵育1 h，TBST 洗滌后向膜中加入化學顯色劑，反應5 min，用化學發光成像系統成像檢測。

1.6 螢光素酶報告基因檢測實驗

將含有miR-193a-3p 結合位點或突變位點的TP53INP1 或ERBB4 的3′UTR 全長序列克隆到pGL3 載體，然后用100 nmol/L 的miR-4461 模擬物或NC 模擬物轉染肺腺癌細胞24 h（NC 模擬物正義引物為5′-CGACUGGUACCAAUGAAC-3′，miR-193a-3p 模擬物正義引物為5′-GCAAUGAC AAGCUUACGAAGG-3′。螢光素酶相對活性統一化為海腎螢光素酶活性，用雙螢光素酶報告基因檢測試劑測定。

1.7 CCK-8 法檢測細胞增殖

實驗分為si-NC 組、si-ERBB4 組、si-ERBB4+miR-193a-3p 抑制劑組及si-ERBB4+oe-TP53INP1組，各組細胞以2×104/孔接種于96 孔板，每組3 個重復，在37℃恒溫培養箱中培養，分別于24、48、72 和96 h 后加入10 μL CCK-8，1 h 后在酶標儀上測定各孔的D450nm值，以時間為橫坐標、D450nm值為縱坐標細胞制增殖曲線。

1.8 統計分析

用GraphPad Prism 7 進行統計學分析。計量數據以x±s表示，2 個獨立組均值間差異采用t檢驗，3 組以上的組間比較采用方差分析法（One-Way ANOVA），組內兩兩多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌組織和細胞中的表達

為了探究ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌中的表達，我們檢測了20 對肺腺癌組織和癌旁組織中ERBB4 和TP53INP1 的表達，還檢測了在肺腺癌細胞系SPC-A-1、H1299 和人類肺上皮細胞BEAS-2B 中ERBB4 和TP53INP1 的表達。如圖1A、B 所示，腫瘤組織中ERBB4、TP53INP1 的表達均比在癌旁組織中低（均為P＜0.0001)，差異具有統計學意義。如圖1C 所示，與人肺上皮細胞BEAS-2B相比，SPC-A-1、H1299 細胞系ERBB4 和TP53INP1表達均顯著降低（均為P＜0.05），差異具有統計學意義。該結果提示，ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌中表達均較低，且組織和細胞系具有一致性。

2.2 ERBB4/TP53INP1 的表達與肺腺癌預后相關

為了探究ERBB4/TP53INP1 表達與肺腺癌預后的關系，我們應用Kaplan-Meier Plotter 分析了ERBB4/TP53INP1 表達與肺腺癌預后的相關性。如圖2 所示，肺腺癌組織中ERBB4/TP53INP1 高表達與整體生存期（overall survival，OS）良好顯著相關，ERBB4/TP53INP1 表達越高，肺腺癌的預后效果就越好，ERBB4 或TP53INP1 表達均可以作為肺腺癌患者整體生存率的獨立預后指標。同時這些結果也表明，ERBB4 和TP53INP1 可能在人類肺腺癌的發生發展過程中發揮關鍵作用。

2.3 ERBB4 與TP53INP1 的表達相關性分析

從上述肺腺癌組織和細胞中的ERBB4 和TP53INP1 表達結果，推測兩者在肺腺癌中的表達可能具有一定的相關性。為此我們做了進一步檢測，結果表明ERBB4 和TP53INP1 的mRNA 表達呈正相關（R2=0.7488，P＜0.0001）（圖3）。

圖1 ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌組織和細胞中的表達水平

圖2 ERBB4/TP53INP1 的表達與肺腺癌預后相關

2.4 ERBB4 沉默/過表達對TP53INP1 蛋白表達的影響

ERBB4 與TP53INP1 的mRNA 表達呈正相關，那么ERBB4 蛋白表達的增減是否影響TP53INP1的蛋白表達量呢？通過Western 印跡檢測ERBB4沉默/過表達對TP53INP1 蛋白表達的影響，結果如圖4，si-ERBB4 沉默表達，TP53INP1 的蛋白表達也明顯降低，而ERBB4 過表達時，TP53INP1 的蛋白表達量也明顯增加。該結果表明ERBB4 沉默或過表達也會影響TP53INP1 蛋白的表達。

2.5 ERBB4 通過靶向miR-193a-3p 調控TP53INP1的表達

圖3 ERBB4 與TP53INP1 的表達相關性分析

圖4 Western 印跡檢測ERBB4 沉默/過表達對TP53INP1 蛋白表達的影響

無論mRNA 還是蛋白表達，ERBB4 和TP53INP1 都呈現密切的相關性。為了探究其中的聯系，我們通過starBase 靶向預測了ERBB4 和TP53INP1 的3′UTR 均有miR-193a-3p 的結合位點，并采用肺腺癌細胞系H1299 進行螢光素酶報告基因檢測，檢測結果（圖5）也驗證了這一點。過表達miR-193a-3p 抑制了ERBB4 和TP53INP1野生型3′UTR 螢光素酶活性（均為P＜0.05），差異具有統計學意義，但是對ERBB4 和TP53INP1 的突變型3′UTR 螢光素酶活性卻沒有影響。該結果提示ERBB4 可能通過靶向調控miR-193a-3p 來調節TP53INP1 的表達，三者構成競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）調控網絡。

2.6 ERBB4-miR-193a-3p-TP53INP1 對肺腺癌細胞增殖的影響

我們進一步探究了ERBB4、miR-193a-3p 和TP53INP1 三者之間的作用聯系。如圖6 所示，沉默ERBB4 后細胞增殖速率顯著增加，但聯合miR-193a-3p 抑制劑或過表達TP53INP1 后細胞增殖速率降低，說明miR-193a-3p 抑制劑和過表達TP53INP1 能夠恢復由沉默ERBB4 造成的細胞增殖率增加，ERBB4 可通過miR-193a-3p/TP53INP1影響肺腺癌細胞增殖。

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，是導致癌癥相關死亡的主要原因[11]；而肺腺癌是最常見的肺癌類型，占原發性肺癌的30%～35%[12]。因此，探究肺腺癌的分子發生機制，對診斷和治療肺癌有著十分重要的意義。ERBB4 在不同人類腫瘤的生長和進展過程中發揮重要作用，但ERBB4 對腫瘤的作用還存在爭議。有研究表明ERBB4 發揮促癌作用[3-7]，但也有研究表明ERBB4 在腫瘤中發揮著抑癌作用[8-10]。傳統上，ERBB4 作為細胞表面受體參與信號轉導，但有研究揭示了ERBB4 可以作為基因轉錄的輔助因子發揮作用，ERBB4 與配體結合后可分裂成多個片段并釋放胞質內結構域，然后胞內結構域會移位到細胞核，作為共轉錄因子，導致基因表達的激活[5,13]。如ERBB4 的下調會導致TP53INP1 的轉錄抑制[10]。我們知道，TP53INP1 是一種關鍵的腫瘤抑制因子，通過增強p53 功能，可以抑制腫瘤的發生[14]。所以，本研究的目的就是探究ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌中的表達及其作用關系。

圖5 螢光素酶報告基因檢測ERBB4 和TP53INP1 均為miR-193a-3p 的靶基因

圖6 ERBB4-miR-193a-3p-TP53INP1 軸對肺腺癌細胞增殖的影響

本研究結果顯示，ERBB4 與TP53INP1 在肺腺癌組織和細胞中均明顯低于正常對照，且兩者的表達呈正相關的關系，ERBB4 沉默或過表達使TP53INP1 的蛋白表達也相應減少或增加。該結果預示著ERBB4 的表達與TP53INP1 的表達可能存在某種聯系。隨后我們通過靶基因預測軟件starBase 和螢光素酶報告基因檢測發現ERBB4 和TP53INP1 均是miR-193a-3p 的靶基因，均受miR-193a-3p 的調控表達。Liang 等[15]也發現ERBB4 受miR-193a-3p 靶向調控。本結果表明ERBB4 通過靶向調控miR-193a-3p 來調節TP53INP1 的表達，三者構成ceRNA 調控網絡，通過細胞增殖實驗發現miR-193a-3p 抑制劑和過表達TP53INP1 能夠緩解由沉默ERBB4 提高的細胞增殖，ERBB4 可以通過miR-193a-3p-TP53INP1 影響肺腺癌進展。Kaplan-Meier 生存曲線結果顯示肺腺癌組織中ERBB4 和TP53INP1 均高表達，與OS 良好顯著相關，ERBB4/TP53INP1 表達越高，肺腺癌的預后效果就越好，ERBB4 或TP53INP1 表達均可以作為肺腺癌患者整體生存率的獨立預后指標。

綜上所述，ERBB4 和TP53INP1 在肺腺癌組織或細胞中均低表達，2 個基因的表達呈正相關，ERBB4通過靶向調控miR-193a-3p 來調節TP53INP1 的表達，且ERBB4 和TP53INP1 表達越高，肺腺癌的預后效果就越好。ERBB4 或TP53INP1 表達可以作為肺腺癌患者預后指標。