單鏈抗體在畢赤酵母中表達的研究進展

林婷，黃義德

福建師范大學生命科學學院，福建福州350100

抗體經歷了四代：一代抗體為異源多克隆抗體，特異性不好；二代抗體為鼠源單克隆抗體，可大量生產高純度的單抗，特異性高；三代抗體為基因工程產生的人源化單克隆抗體，減少了鼠源抗體帶來的免疫排斥問題；第四代抗體為全人源單克隆抗體。從鼠源抗體到人鼠嵌合抗體再到人源化抗體，以及發展到現在的全人源抗體，逐漸解決了人體的免疫排斥問題[1]。由于全尺寸的抗體通常是相對分子質量約150×103的免疫球蛋白G1 形式，這種大分子存在2 個基本問題：一是它們對組織（如實體瘤）的滲透性差；二是與某些分子表面上的區域（如人類免疫缺陷病毒包膜糖蛋白）的結合不良或結合不上，而那些區域能夠被較小尺寸的分子結合[2]。抗體作為治療性藥物并非每個部分都是必需的，有報道顯示若只有與抗原結合的可變區的存在，抗體依舊能夠發揮其作用。因此，科研人員研制出了多種形式的小分子抗體，如單域抗體、單鏈抗體和雙體抗體。片段抗體越小半衰期越短，單域抗體的半衰期只有幾分鐘[1]，單鏈抗體（single-chain variable fragment，scFv）的半衰期相對較長一些，在體內降解較單域抗體慢。單鏈抗體是通過15～20 個氨基酸殘基的短肽（linker）將一條抗體重鏈可變區和一條輕鏈可變區連接起來的。缺乏恒定區的單鏈抗體依舊能夠穩定地與抗原特異性結合并發揮作用[3]。單鏈抗體相對分子質量只有25×103，結構穩定，可溶，并且易于采用微生物表達獲得。目前，單鏈抗體在醫學方面主要用于抗腫瘤、抗病原生物、自身免疫疾病研究、心血管疾病研究以及抗輻射損傷等；在食品安全方面主要用于食品毒素檢測、農獸藥物殘留檢測以及食品中重金屬污染檢測。因此單鏈抗體的需求量日益增長，其大量獲得與制備一直是研究的焦點。

1 單鏈抗體的發展及應用

1.1 單鏈抗體的發展

單鏈抗體最早是在駱駝科動物的血清中發現的，之后于1988 年，首次被Bird 和Huston 研制獲得[4]。只由一條輕鏈可變區和重鏈可變區組成的單鏈抗體稱作單價單鏈抗體。在單鏈抗體制備技術逐漸成熟的過程中，研究人員對單鏈抗體進行了改進，繼單價單鏈抗體之后出現了單鏈抗體多聚體。該抗體是經過縮短其linker 的長度，使得多個單鏈抗體結合在一起，增加了針對抗原的特異性。1993 年，Holliger 等同時表達了2 種不同特異性的單鏈抗體，其能同時與不同的抗原結合，于是稱之為雙特異性單鏈抗體[5]。

迄今，單鏈抗體所運用的展示系統有噬菌體展示系統、核糖體展示系統和酵母表面展示系統；其表達系統有原核細胞表達系統、酵母表達系統、哺乳動物細胞表達系統、昆蟲表達系統及植物細胞表達系統；其運用到的基因轉染技術有磷酸鈣共沉淀技術、脂質體技術和電穿孔技術[6]。

1.2 單鏈抗體的應用

單鏈抗體屬于小分子抗體，穿透性好，靶向性好，副作用小，在醫學和食品安全方面都有廣泛的應用。

在抗腫瘤中單鏈抗體用于靶向治療，治療形式主要有靶向性病毒載體、靶向脂質體及單鏈抗體融合蛋白等。單鏈抗體還可用于腫瘤的影像分析，經過放射性同位素標記的單鏈抗體可輕易滲入腫瘤形成清晰的影像，從而達到特異性放射治療。例如，IFN-γ與碘標記的scFv 使得腫瘤顯像效果極強[7]。

在抗病原微生物方面，單鏈抗體已經用于丙肝病毒、乙肝病毒、狂犬病病毒和牛冠狀病毒等常見病毒。胡娟制備了抗狂犬病毒磷蛋白單鏈抗體-堿性磷酸酶融合蛋白，初步應用獲得了很好的效果[8]。單鏈抗體也用于抗動植物各種致病細菌的研究，鄭子欽制備了抗丁香假單胞菌HrpA單鏈抗體[9]。單鏈抗體也可用于抗寄生蟲，單超構建了抗利什曼原蟲表面糖蛋白的單鏈抗體庫，為后續的該抗體應用奠定了基礎[10]。

單鏈抗體在抗自身免疫疾病、抗心血管疾病以及抗輻射損傷方面也都有研究。在艾滋病治療上已制備出單鏈抗體b12-scFv、ScAb2219 等[11]；在心血管疾病上已制備了抗膽固醇酯轉運蛋白的scFv 等；抗Ras 單鏈抗體則能夠抗輻射損傷[12]。

單鏈抗體在食品安全方面主要用于食品毒素檢測、農獸藥物殘留檢測以及食品中重金屬污染檢測[13]。

2 單鏈抗體在畢赤酵母中的重組表達

單鏈抗體的表達系統類型如上述，這些表達系統都有各自的優點和不足。酵母表達系統包括畢赤酵母表達系統和釀酒酵母表達系統。畢赤酵母惟一的碳源為甲醇，屬于甲醇營養型酵母。相對于釀酒酵母，畢赤酵母含有一個強有力的受到嚴格調控的啟動子醇氧化酶1（AOX1），可以進行高密度發酵，且分泌效率比釀酒酵母高[14]。

與其他表達系統相比，畢赤酵母具有表達菌株穩定、表達質粒不易丟失、可高密度發酵、表達周期短、操作簡單、成本低、能對表達的外源蛋白進行有限的翻譯后加工修飾，以及幾乎沒有人類致病病毒感染風險等優點，現已成為重要的工業微生物。近年基因組測序的完成以及轉錄組和蛋白組數據的積累，為研究者提供了清晰的畢赤酵母遺傳背景[15]。人源化糖基化菌株的工程化，意味著除了酶和堿性蛋白質之外，還可以產生更復雜的蛋白質，使得抗體或抗體片段能夠擁有更高的生物活性。同時標準的分子遺傳操作方法和CRISPR-Cas9 技術的建立，已經為畢赤酵母在合成生物學上的應用鋪平了道路[16]。

雖然畢赤酵母表達系統在表達外源蛋白上有很大的優勢，但不同來源的蛋白在畢赤酵母中的表達量存在差異，已經有許多外源蛋白的表達量達到克每升數量級，而目前單鏈抗體的表達量幾乎只能達到毫克每升數量級（表1）。因此，優化畢赤酵母表達系統對于提高單鏈抗體表達量至關重要。

表1 單鏈抗體在畢赤酵母中的表達量

續表1 單鏈抗體在畢赤酵母中的表達量

3 提高單鏈抗體在畢赤酵母中的表達量可采取的策略

畢赤酵母表達系統表達外源蛋白，其表達量在分子水平上的影響因素有外源基因的內在特性、基因拷貝數、啟動子、信號肽的選擇、糖基化修飾、分子伴侶及外源蛋白降解等；在工業化水平上，發酵條件和發酵工藝也影響了表達量。下文主要描述分子水平上的影響因素及其高表達策略。

3.1 外源基因的內在特性

由于外源基因的內在特性，其影響因素主要有3 個。①密碼子偏好性。不同物種的密碼子使用頻率是不一樣的，外源蛋白在畢赤酵母中表達，其中的稀有密碼子會阻礙翻譯的進行甚至提前終止翻譯。可以根據同義密碼子的替換和畢赤酵母的密碼子使用頻率來優化外源蛋白的基因序列，從而提高表達量[76]。有研究者將抗ErbB2 單鏈抗體進行密碼子優化，產量由1～2 mg/L 提高到6～10 mg/L[67]。②A+T 含量。畢赤酵母中轉錄提前終止信號為一段共有序列ATTATTTTA TAAA，A+T 含量高的基因容易出現轉錄提前終止的情況，從而影響表達量。可將A+T 含量高的序列重新設計，將A+T 的含量控制在30%～55%[77]。③mRNA 5′非翻譯區（5′UTR）。5′UTR 的長度和核苷酸成分影響了外源蛋白的表達，適當的長度可以使mRNA 順利進行有效翻譯。5′UTR 的長度不合適會使核糖體40S 亞單位發生識別障礙。AOX1 基因的5′UTR 長度為114 bp 且A+U 含量高時，其編碼的醇氧化酶的表達量也非常高，因此保持外源蛋白5′UTR 與AOX1 的5′UTR 一致是必須的[78]。

3.2 基因拷貝數

外源蛋白的表達量受基因拷貝的影響，相比于單拷貝基因，多拷貝基因的表達量會高很多，可以將帶有卡那霉素抗性基因的表達載體導入畢赤酵母菌，使畢赤酵母獲得G418 抗性，便可通過轉化子對G418 的抗性快速篩選出拷貝數高的轉化子[79]。但并非拷貝數越多其表達量越大，當拷貝數達到極限后無論拷貝數怎么增加，其表達量還是一樣的，甚至在有限的資源和能量的細胞內，拷貝數過多可能會給轉錄和翻譯造成負擔，從而抑制蛋白的表達[80]。有研究者將甘露聚糖酶的拷貝數分別提高到2、4、6 倍，其表達量比單拷貝分別增加了1.7、2.2 和1.3 倍[81]。

3.3 啟動子

一般在表達外源蛋白時選擇強啟動子可以提高蛋白的表達量。然而強啟動子對于有些外源蛋白來說并不能提高其表達量，因為過量表達有時會導致蛋白折疊與定位錯誤，這些蛋白選擇弱啟動子更具優勢[82]。因此，啟動子的合理選擇和使用也很關鍵。高源等構建了AOX1 和FLD1的雙啟動子質粒，在畢赤酵母中表達重組FGF1蛋白，其產量為197 mg/L，大約是目前已知最高表達水平的2 倍[83]。

3.4 信號肽的選擇

畢赤酵母表達的外源蛋白大部分是胞外蛋白，這些蛋白分泌到胞外需要信號肽引導外源序列共轉錄到內質網，因此胞外蛋白的獲得量與信號肽的選擇息息相關。有報道，經過改變信號肽的疏水性、改變序列、使用密碼子偏好性、進行位點突變等，可以增加外源蛋白的分泌效率[80]。謝濤將畢赤酵母的信號肽序列進行密碼子優化后，用于表達2 個突變的植酸酶phyA 基因的突變基因phyA～m 和phyA～（m-4），其酶活性較信號肽改造之前分別提高了3.95 和1.53 倍[84]。

3.5 糖基化修飾

真核生物蛋白基本上都需要糖基化修飾后才可正確折疊、分泌并具有活性。畢赤酵母中存在2 種糖基化形式，即O-糖基化與N-糖基化[79]。畢赤酵母的糖基化主要是指N-糖基化，盡管其程度比釀酒酵母要弱，但是和天然蛋白相比還是存在糖基化過度問題。研究表明，在不影響蛋白活性的情況下，對N-糖基化位點進行突變、去除或引進新的糖基化位點，可提高分泌蛋白在畢赤酵母中的表達量及重組蛋白過度糖基化問題[82]。有研究者在疏水性角質酶的N 端區域引入N-糖基化共有序列，分泌增加了5 倍[85]。

若表達的蛋白質是抗體，其需要正確的糖基化模式以便抗體正確折疊。糖基化改造的人源化巴斯德畢赤酵母表達系統可以產生具有與哺乳動物系統類似的糖基化譜的糖蛋白。由人源化巴斯德畢赤酵母系統產生的治療性糖蛋白在臨床前模型中顯示出與由CHO 細胞產生的蛋白有相當的折疊、穩定性和體外體內功效[86]。

3.6 分子伴侶

分子伴侶是具有協助細胞內其他分子組裝及蛋白質正確折疊功能的蛋白質。畢赤酵母分泌的蛋白需要在內質網上形成二硫鍵及正確折疊后運輸至高爾基體。在內質網上，分子伴侶參與了這2 種蛋白質修飾，分子伴侶還可以與內質網上的新生肽相互作用保持其可溶形式[87]。內質網上的分子伴侶主要有蛋白質二硫鍵異構酶（PDI）、人免疫球蛋白結合蛋白（BIP）、鈣聯蛋白和鈣網蛋白。PDI 是硫氧還蛋白超家族成員，能夠催化二硫鍵的形成及幫助蛋白正確折疊；BIP能夠結合到疏水性氨基酸延伸端來穩定未成熟的蛋白[88]。因此，分子伴侶對于畢赤酵母分泌蛋白起著重要的作用。許多研究表明，分子伴侶和外源基因一起表達，外源蛋白的表達量可以明顯提高，例如陳飛等將灰蓋鬼傘過氧化物酶與分子伴侶PDI 共表達，其酶活性較共表達之前提高了2.43 倍[89]。

3.7 外源蛋白降解

由于畢赤酵母中存在蛋白水解酶，所以外源蛋白無論是胞內蛋白還是胞外蛋白，在表達和分泌過程中都存在被蛋白水解酶降解的風險，影響其表達量[90]，因此降低相關外源蛋白水解酶是非常必要的。有研究者敲除了畢赤酵母的相關蛋白酶基因，并證明蛋白酶基因的敲除可以提高外源蛋白的產量。目前已有商業化的蛋白酶缺陷畢赤酵母菌株可供選擇[91]。降低外源蛋白降解的策略還有：共表達目的蛋白和蛋白水解酶抑制劑，該策略目前還在探索階段；將目的蛋白與過氧化物酶體靶向信號連接，目的蛋白即可轉運到過氧化物酶體中，免受蛋白酶降解；對外源蛋白序列進行改造，去除蛋白酶作用位點且不改變原有蛋白性質[80]。