裂谷熱病毒截短型Gc蛋白的真核表達與純化

郝勐，張勝男，李建民，夏咸柱

1.中國醫學科學院&北京協和醫學院醫學實驗動物研究所比較醫學中心，北京100021；2.軍事醫學研究院生物工程研究所，北京100071；3.東北林業大學野生動物與自然保護地學院，黑龍江哈爾濱150040；4.軍事醫學研究院軍事獸醫研究所，吉林長春130000

裂谷熱（Rift Valley fever，RVF）是由一種蚊媒病毒引起的急性人獸共患病，20 世紀初主要流行于肯尼亞境內的東非大裂谷區域，因此該病毒得名為裂谷熱病毒（Rift Valley fever virus，RVFV）[1]。RVFV 可以導致牛、羊和駱駝等動物的母畜流產，流產率可高達100%，并對幼畜具有較高的致死率。同時，RVFV 可以導致人類發熱、肌肉疼痛，嚴重可至神經紊亂、視力減弱、出血熱，甚至死亡[2]。裂谷熱病毒屬于布尼亞病毒科白蛉熱病毒屬，是單股負鏈分節段的RNA病毒，其基因組由L、M 和S 片段構成，其中，L 片段編碼病毒復制所需的RNA 依賴的RNA 聚合酶（RdRp），M片段編碼病毒的糖蛋白Gn、Gc 和非結構蛋白NSm，S 片段以雙義的形式編碼病毒的核蛋白N和非結構蛋白NSs。Gn 和Gc 蛋白主要介導病毒的吸附、入侵和膜融合過程，因此，這2 個蛋白成為設計RVFV 疫苗和中和抗體的主要靶標。

自裂谷熱病毒被分離后，裂谷熱疫情不斷發生[3]。1950～1998 年，裂谷熱疫情主要發生于非洲地區，南非、肯尼亞、埃及以及東非一些國家均暴發過多次較大規模的人感染裂谷熱病毒的疫情，并且造成了數百人的死亡[4-8]。2000 年，有研究者首次報道了發生在非洲大陸以外的裂谷熱疫情，該疫情發生于沙特阿拉伯，在6 個月的時間內有總計880 例實驗室確診患者，其中123 名患者死亡[9]。在此期間也門也發生裂谷熱疫情，1328 名感染患者中有166 人死亡。研究表明，引起阿拉伯半島疫情的裂谷熱病毒毒株與導致1997～1998年東非疫情的毒株是一致的[10]。距今較近的疫情發生于2008 年的蘇丹，總計747 感染患者中有230 人死亡。2016 年，在尼日爾和東非發生了小規模疫情，導致數人死亡[11]。同年，我國也發現首例輸入性裂谷熱病例[12]。上述研究表明，裂谷熱病毒有跨區域傳播的趨勢。然而，目前暫無商品化的疫苗或抗體用于預防或治療RVFV 的感染。

在本研究中，我們利用懸浮型293 細胞表達了RVFV 截短型Gc 蛋白（691～1119 aa），并對該蛋白進行了純化及免疫反應性鑒定，為后續RVFV亞單位疫苗的研發和中和抗體篩選提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Expi293F 細胞、真核表達載體pCAGGs、抗Gc蛋白兔多抗、Gc 蛋白單克隆抗體B6 以及馬爾堡病毒GP 蛋白單克隆抗體1A8 均由本研究室保存；大腸桿菌Top10 感受態細胞、去內毒素質粒大提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內切酶EcoRⅠ、NotⅠ和NEBuilder 同源重組酶購自NEB 公司；膠回收試劑盒購自Omega 公司；Expi293F 細胞培養基及轉染試劑購自Thermo Fisher 公司；StrepTrap 預裝柱購自GE 公司；TMB單組分顯色液和終止液購自索萊寶公司；山羊抗兔二抗（HRP）、山羊抗人二抗（HRP）購自Abcam公司；Western 印跡顯色液購自Millipore 公司；RVFV M 片段的開放讀框基因（pUC57-MORF）由生工生物工程（上海）公司優化并合成。

1.2 真核表達質粒的構建

利用重疊延伸PCR 將有助于目的蛋白分泌表達的tPA 信號肽和純化標簽StrepⅡ-tag 克隆至截短Gc 蛋白基因的5′端和3′端。具體流程如下：以pUC57-MORF 為模板，利用上游引物OpGc2-F和下游引物GC-C-Strep2R 進行PCR 擴增，將tPA信號肽和StrepⅡ-tag 的部分序列克隆至截短Gc基因的5′端和3′端，并進行膠回收；然后，以上述所得片段（opGc2-c）為模板，利用上游引物tPA-F和下游引物Strep1R 進行PCR 擴增，將tPA 信號肽和StrepⅡ-tag 的剩余部分序列克隆至截短Gc 基因的5′端和3′端，以獲得含有完整的tPA 信號肽序列和StrepⅡ-tag 序列的截短Gc 基因（opGcc1），進行膠回收，用限制性內切酶EcoRⅠ/NotⅠ對真核表達載體pCAGGs 進行雙酶切，并進行膠回收；最后，通過同源重組酶將所得目的基因和表達載體連接，轉化大腸桿菌TOP10 感受態細胞，挑取單克隆菌落送生工生物工程（上海）公司測序，將測序正確的單克隆菌落進行去內毒素大提，獲得質粒pCA-Gcopt-c 以備后續轉染使用。所用引物及序列見表1。

1.3 RVFV 截短型Gc 蛋白在Expi293F 懸浮型細胞中的表達

轉染前，將3×106Expi293F 細胞接種于30mL Expi293F 表達培養基中，于5% CO2、37℃、120 r/min 條件下持續培養數小時，當細胞密度達3.5×106/mL 時，將80 μL ExpiFectamine293 轉染試劑加入1.5 mL 培養基中混勻，室溫孵育5 min。將30 μg pCA-opGc-c 加入1.5 mL 培養基中混勻，然后將孵育好的轉染試劑與培養基的混合物加入質粒與培養基的混合物中輕輕混勻，室溫孵育25 min，最后緩慢加入細胞培養瓶中。培養16 h 后，在上述細胞培養瓶中分別加入150 μL轉染增強劑1 和1.5 mL 轉染增強劑2，培養數小時后取細胞上清進行截短Gc 表達量的鑒定。

表1 引物及序列

1.4 RVFV 截短型Gc 蛋白表達量的鑒定

取上述添加轉染增強劑后培養84 h 的細胞培養液50 μL，4℃、12 000 r/min 離心5 min，用含有還原劑的蛋白上樣緩沖液制樣并電泳；電泳結束后，用濕轉方法將蛋白轉移到經甲醇激活的PVDF 膜上；轉膜后，用5%脫脂乳對PVDF 膜室溫搖床封閉1 h，分別用抗Gc 兔多抗（1∶5000）和StrepⅡ-tag（HRP）抗體（1∶30 000）與封閉后的PVDF 室溫孵育1.5 h；用PBST 清洗PVDF 膜3 次，每次10 min；以1∶10 000 的比例加入羊抗兔二抗（HRP）室溫孵育1 h；用PBST 清洗PVDF 膜3 次，每次10 min；利用Western 印跡顯色液進行顯色。

1.5 RVFV 截短型Gc 蛋白在Expi293F 細胞中不同時間點表達量的鑒定

在完成轉染并添加轉染增強劑后，每隔12 h收取細胞培養基100 μL，直至收到第96 h，每次收取培養基后，立即測定Expi293F 細胞的活率，然后4℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清制備樣品進行Western 印跡，方法同1.4。

1.6 RVFV 截短型Gc 蛋白的純化

收取細胞上清，用0.22 μm 濾膜過濾。上樣前，先用平衡緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH8）對StrepTtrap親和柱進行平衡，平衡5 個柱體積后上樣，同時收取柱后。上樣結束后繼續平衡5 個柱體積。平衡結束后，用洗脫緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA, 2.5 mmol/L脫硫生物素，pH8）進行洗脫，收集洗脫峰。最后，對收集的目的蛋白進行SDS-PAGE 和Western 印跡鑒定。

1.7 BCA 法測定蛋白濃度

根據標準品和樣品數量，將A 液和B 液按50∶1 的比例充分混勻配制成適量的BCA 工作液。取標準品和待測蛋白樣品，按10 μL/孔加入96 孔板中，每個樣品各做一個復孔，各孔加入200 μL BCA 工作液，避光，37℃孵育30 min。最后用酶標儀測定D570nm值，并根據標準曲線計算蛋白濃度。

1.8 ELISA 檢測RVFV 截短型Gc 蛋白的免疫反應性

取純化的截短型Gc 蛋白包被酶聯板（2 μg/mL，100 μL/孔），4℃過夜，PBST 洗滌3 次后，用2% BSA 于37℃封閉1 h；洗滌3 次后加入初始濃度為10 μg/mL 的B6 和1A8，以1∶3 的比例梯度稀釋，37℃孵育1 h；洗滌3 次后加入HRP 標記的羊抗人二抗，37℃孵育1 h；洗滌3 次后加入100 μL TMB 單組分顯色液，室溫顯色5 min，再加入50 μL 終止液，最后用酶標儀讀取D450nm-D630nm值。

2 結果

2.1 RVFV 截短型Gc 蛋白真核表達質粒的構建

重疊延伸PCR 中第1 次擴增的DNA 片段Op-Gc2-c 為1323 bp，第2 次PCR 擴增所得DNA 片段OpGc1-c 為1590 bp，核酸電泳結果顯示條帶大小均與預期相符（圖1）。利用同源重組將目的片段克隆至真核表達載體pCAGGs 后，挑取單克隆菌落測序，測序結果顯示目的片段與預期完全一致，沒有任何突變和缺失，將構建的質粒命名為pCA-Gcopt-c。

2.2 RVFV 截短型Gc 蛋白真核表達量的鑒定

將測序正確的真核表達質粒pCA-Gcopt-c 轉染Expi293F 細胞，84 h 后收取細胞上清，利用Western 印跡鑒定截短型Gc 蛋白的表達量，結果如圖2?？笹c 蛋白的兔多抗和針對StrepⅡ-tag 的抗體都可以特異地檢測到Expi293F 細胞上清中的截短型Gc 蛋白，且蛋白大小與預期結果相符。同時，抗Gc 蛋白的兔多抗和針對StrepⅡ-tag 的抗體可以同時與一個相對分子質量約為23×103的蛋白結合，我們推測該蛋白為Gc 蛋白斷裂所致。

2.3 RVFV 截短型Gc 蛋白在Expi293F 細胞中不同時間點表達量的鑒定

上述結果顯示，RVFV 截短型Gc 蛋白在Expi293F 細胞中有較高的表達量。但是為了能夠進一步提高截短型Gc 蛋白的表達量，我們對轉染后不同時間點的Expi293F 細胞表達截短型Gc 蛋白的量進行了Western 印跡鑒定，同時測定了不同時間點Expi293F 懸浮細胞的活率，以確定最晚收取細胞上清的時間，結果如圖3。截短型Gc 蛋白的表達量在轉染后96 h 最高，此時Expi293F 細胞的活率降到了41%（圖4），已不適于繼續培養。因此，我們確定轉染后96 h 為收取細胞上清的最佳時間。

圖1 重疊延伸PCR擴增RVFV截短型Gc片段

圖2 Western印跡鑒定RVFV截短型Gc蛋白

圖3 截短型Gc蛋白在Expi293F細胞中不同時間點的表達量

2.4 RVFV 截短型Gc 蛋白的純化及鑒定

在確定最佳細胞上清收獲時間后，我們利用StrepTrap 親和柱對收獲后的細胞上清進行了純化，同時在純化過程中收取了目的蛋白的洗脫峰、柱前和柱后，進行SDS-PAGE 分析，結果如圖5，在收取的洗脫峰中獲得了純度較好的截短型Gc 蛋白。用BCA 方法測定的純化后的Gc 蛋白濃度為0.7 mg/mL。最后，利用抗Gc 蛋白的兔多抗和針對Strep 標簽的抗體對洗脫峰中的蛋白進行了Western 印跡鑒定，結果如圖6，抗Gc 蛋白的兔多抗和針對Strep 標簽的抗體不僅可以與純化后的截短型Gc 蛋白特異性結合，還可以與一個大小約為23×103的蛋白結合，與圖2 結果一致。

2.5 ELISA 檢測RVFV 截短型Gc 蛋白的免疫反應性

在得到比較純的截短型Gc 蛋白后，我們通過ELISA 實驗，利用Gc 蛋白的單克隆抗體B6 對截短型Gc 蛋白的免疫反應性進行了初步檢測，結果如圖7。單克隆抗體B6 與截短型Gc 蛋白具有良好的結合活性，而馬爾堡病毒GP 蛋白的單克隆抗體1A8 對照與截短型Gc 蛋白沒有結合活性，說明我們通過真核表達并純化所得的截短型Gc 蛋白具有較好的免疫反應性。

圖4 轉染后96 h內Expi293F細胞活率的變化情況

圖5 純化后的截短型Gc蛋白的SDS-PAGE分析

3 討論

裂谷熱病毒是一種蚊媒且人獸共患的烈性病原，同時也是一種潛在的生物戰劑。目前國際上尚無獲批的疫苗或藥物來預防和治療裂谷熱病毒的感染。隨著全球化程度的日益加深，裂谷熱病毒跨區域傳播的趨勢愈發明顯，2018 年世界衛生組織公布的當前最需要關注的十大病原，裂谷熱病毒仍位列其中[13]。裂谷熱病毒的預防和治療引起了越來越多的研究者的關注。裂谷熱病毒的Gn 和Gc 蛋白在病毒入侵過程中起重要作用，因而是裂谷熱病毒疫苗和中和抗體研發的主要靶點，獲得純化的Gn 和Gc 蛋白具有重要的生物學意義。

圖6 純化后的截短型Gc蛋白的Western印跡

圖7 ELISA檢測截短型Gc蛋白的免疫反應性

目前，裂谷熱病毒Gc 蛋白多為原核表達。在原核表達過程中，大腸桿菌并不能夠對Gc 蛋白進行糖基化。相較于原核表達系統，真核表達系統更能模擬病毒在感染人或動物后，Gc 蛋白在真核細胞中翻譯、折疊及成熟的過程，使之更貼近天然構象。研究表明，裂谷熱病毒的Gc 蛋白存在數個位點的糖基化修飾，而這些糖基化修飾對Gc 蛋白的構象維持具有重要作用[14-15]。

在本研究中，我們利用Expi293F 懸浮細胞表達裂谷熱病毒截短型Gc 蛋白，并純化得到純度較高的Gc 蛋白。我們發現Gc 蛋白容易發生斷裂，但導致該現象的具體因素以及該蛋白具體斷裂位點尚未見相關報道，仍須進一步研究。通過SDS-PAGE 可以看出斷裂所致蛋白較少，應不影響對截短型Gc 蛋白的后續研究與應用。最后，我們也對純化后蛋白的免疫反應性進行了初步檢測，結果顯示該蛋白的免疫反應性較好，可用于后續疫苗抗原開發和中和單抗的篩選。