陜產柿葉總黃酮磷脂復合物制備工藝研究

陳 吼

(楊凌職業技術學院，陜西 楊凌 712100 )

柿葉為柿科植物柿DiospyroskakiThunb.的葉，華東、陜西、甘肅等地是其主要分布地，其中陜西為大宗產地。在傳統的應用中以及現代的藥理學研究表明，止咳平喘是柿葉最主要也是被應用最多的功效，臨床常用于咳喘，消渴及各種內出血，臁瘡，也可以生津止渴，也可以活血止血。柿葉主要含有黃酮類、萜類、萘醌萘酚類、香豆素類、揮發性等化學成分[1]，以其提取物制成的腦心清片作為國家中藥保護品種應用于臨床，同時，柿葉作為一種保健食品被制備成各種飲料和食品而廣泛應用于我們的生活中，黃酮類是柿葉中所有活性成分中最主要的有效成分，可是其脂溶性與水溶性差強人意，二者都較差，從而也反映出了它本

身的這種理化性質會使其生物利用度較低。大豆卵磷脂與難溶性藥物制成的磷脂復合物可有效地提高溶解度較低的藥物在體內的吸收，可以顯著提高藥物進入人體內的吸收速率，從而達到一個很好的治療效果[2～4]。筆者以陜西富平產柿葉為原料，提取其中含有的總黃酮，并采用溶劑法制備了磷脂復合物，為進一步研制柿葉新制劑和優選出適宜的制備方法奠定了基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

在本次研究過程中對經常使用較大型號的實驗儀器型號和廠家進行了如表1所示記錄和總結：

表1 實驗中使用的儀器

1.2 藥品與試劑

柿葉 (采集于陜西富平，經陜西中醫藥大學王昌利教授鑒定為正品)；柿葉總黃酮(自制，以蘆丁為對照品測定含量為52%)，大豆卵磷脂(含氮量>99.8%，成都市科龍化工試劑廠)；甲醇、無水乙醇、四氫呋喃，乙酸乙酯等均為分析純。

2 實驗方法與結果

據與筆者實驗相關的文章描述[5～7]，影響磷脂復合物形成的因素主要有以下幾種：如我們所選取的反應溶劑的類型、投入藥物的量和所投入磷脂的量的比例、反應所需要的時間、反應控制的溫度和藥物濃度等。以總黃酮與大豆卵磷脂結合程度作為評價的標準，并且采用單因素和正交設計試驗，對柿葉總黃酮磷脂復合物制備條件進行詳細的研究。

2.1 磷脂復合率計算方法[8]

柿葉中所含的總黃酮是一種難溶于有機溶劑氯仿的物質，而磷脂及柿葉總黃酮磷脂復合物易溶于氯仿。用定量的總黃酮和磷脂在一定條件下進行反應，減壓干燥除去反應溶劑，加入一定量的氯仿，待充分溶解磷脂及磷脂復合物后，過濾，并取少量的氯仿洗滌容器，分別收集濾液與沉淀，將沉淀干燥后稱重，并計算柿葉總黃酮與磷脂的復合率，計算公式如下：

復合率=[(總黃酮的初始投藥量-沉淀量)/總黃酮的初始投藥量]×100%

2.2 單因素影響試驗

2.2.1 反應溶劑種類考察 使用分析天平，取適宜量的總黃酮進行精密稱定，使其與大豆卵磷脂按1∶4 (w/w)的比列來進行投料，分別于不同反應溶劑中進行復合，控制溫度為50 ℃，反應1.5 h，總黃酮的濃度為 5.0 mg·mL-1，磁力攪拌速度為120 r·min-1，計算總黃酮與磷脂的結合百分率，確定適宜反應溶劑，實驗平行進行三次，結果見圖1A，我們可以清晰的看出以四氫呋喃作為該反應的反應溶劑時二者的復合率最高，最終確定四氫呋喃最符合我們的要求，為總黃酮最佳的反應溶劑。

2.2.2 投料比考察 精密稱取總黃酮適量，以四氫呋喃為反應溶劑，控制其他因素不變，分別對總黃酮與大豆卵磷脂投料比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4時的磷脂復合率進行考察，實驗平行進行三次，結果見圖1B，從圖中我們可以清晰的看出復合率隨磷脂用量的增加而不斷上升，因此為了確保整個體系較高的復合率，我們確定了總黃酮和大豆卵磷脂的投料比最佳應該為1∶4。

2.2.3 總黃酮濃度考察 精密稱取總黃酮適量，以為四氫呋喃反應溶劑，投料比1∶4，控制其他因素不變，分別考察總黃酮濃度為2.5、5、10 mg·mL-1時的復合率，實驗平行進行三次，結果見圖1C，可知總黃酮濃度為5 mg·mL-1時復合率最高。

2.2.4 反應溫度考察 精密稱取總黃酮適量，將四氫呋喃作為反應的溶劑，使用最佳的藥物投料比為1∶4，實驗過程中我們取的總黃酮濃度為5 mg·mL-1，控制其他因素不變，我們分別對25、40、50、60℃時的復合率進行了考察，實驗平行進行三次，結果見圖1D，可以清晰的看到反應溫度對體系的復合率影響較為顯著，且呈正比關系，但如果將溫度升高至50℃時復合率增加變得緩慢，因此我們可以確定適宜反應溫度應該為50℃。

圖1 單因素實驗考察結果

2.2.5 反應時間考察 精密稱取總黃酮適量，將四氫呋喃作為反應溶劑，使用最佳的投料比1∶4，使用的總黃酮濃度為5 mg·mL-1，控制其他因素不變，在保持50℃不變的情況下，使其分別反應1、1.5、2、3 h，然后計算其復合率，實驗平行進行三次，結果見圖1E，從圖中可以看出1.5 h 時反應基本完全，同時也可以了解到復合過程受反應時間因素的影響相對于其他因素而言是比較小的。

2.2.6 攪拌速度考察 精密稱取總黃酮適量，將有機試劑四氫呋喃作為其反應溶劑，選用最佳投料比1∶4，使用的總黃酮濃度為5 mg·mL-1，將溫度控制在50℃，使其反應1.5 h，分別將磁力攪拌速度設置為120、240、480、960 r·min-1時對其復合率進行考察，結果見圖1F，我們可以清晰地看出當設置的攪拌速度達到480 r·min-1時，體系中總黃酮的復合率將不再隨轉速的增加而提升。

綜上可知，反應溶劑所選取的類型、各種投料所占比例、反應所控制的溫度大小、總黃酮濃度對磷脂復合率有著顯著的影響，而對總黃酮的復合率的影響相對而言比較小的則是攪拌速度、反應時間。

2.3 正交設計試驗

結合單因素試驗的結果，我們以總黃酮與卵磷脂的投料比例、選取的總黃酮濃度以及反應時間和反應溫度等作為影響因素進行考察，以總黃酮磷脂復合率作為優化制備工藝的評價指標，并采用L9(34)試驗設計進行正交實驗考察，因素與水平表見表2。

將其因素與水平導入正交助手可以得出其相應的均值1、均值2、均值3 以及極差，結果如表3 所示，我們可以清晰的看出均值 95.327 是比較大的，因此可以選出最佳的溫度為60℃，極差分析顯示，各因素對復合率的影響順序為A>C>D>B。如表4方差分析結果所示，A因素，即反應時間的影響具有顯著意義，溫度越高，復合率越高，故應選擇A因素最高水平60℃。復合率會隨磷脂用量的增加而增加，但磷脂過多亦會引起復合物黏性大、制劑困難等缺點，因此我們選用了1∶3的投料比，從整體來看，反應時間和其藥物濃度對復合率的影響并不是特別顯著，結合實際條件綜合權衡后，確定柿葉總黃酮磷脂復合物的最為適宜的制備方法為：取總黃酮適量，磷脂投料比1∶3(w/w)，選用濃度為5.0 mg·mL-1的總黃酮，以四氫呋喃為反應溶劑，于60℃下，控制磁力攪拌器轉速為480 r·min-1反應1 h即得。

表2 因素與水平

表3 正交試驗結果

表4 方差分析

表5 驗證試驗

2.4 驗證試驗

稱取一定量的總黃酮，按照選取出的最佳制備工藝進行制備磷脂復合物，并且進行重復三次實驗予以驗證，實驗結果見表5。可見，驗證試驗結果與正交試驗結果平均偏差為0.91%，表明我們選取的最佳制備工藝是穩定且可行的。

3 討論

在反應溶劑種類的考察過程中，將有機溶劑四氫呋喃作為反應溶劑會比將無水乙醇作為反應溶劑所得到的復合率均較高，但比較所得產物的性質，四氫呋喃較好，因此我們選定了四氫呋喃為本次實驗研究的反應溶劑。磷脂用量較大時在溶液中濃度會比較高，因此會與藥物分子碰撞的機會也會隨之增多，我們得到的復合率會隨磷脂用量的增加而增多，但如果我們加入過多的磷脂亦會引起復合物黏性大，從而造成制劑困難等缺點，因此，筆者實驗將投料比的考察范圍設定1∶1～5，通過正交實驗考察，在確保復合完全的同時保證產物質量的前提下，確定了總黃酮與磷脂投料最佳比為1∶3(w/w)。

磷脂復合反應是吸熱反應，溫度越高，其反應速度越快快，反應平衡常數越大，即理論復合率越高；但由于磷脂遭遇高溫時容易被破壞，因此在保證復合效率的前提下，我們將溫度設定為60℃較為適宜。

綜上，筆者實驗通過正交實驗確定了柿葉總黃酮磷脂復合物的最佳制備工藝，以期通過改善其難溶性而提高生物利用度，但筆者實驗僅停留于工藝研究層面，尚需體外及體實驗進行進一步的驗證。