茄子花藥誘導胚狀體研究

梁寶萍，王 勇，趙紅星，李 艷，姜 俊，段 瑩

(駐馬店市蔬菜遺傳育種工程技術研究中心 駐馬店市農業科學院,河南 駐馬店 463000)

花藥培養是獲得單倍體的有效途徑之一，縮小育種群體規模和年限，提高選擇效率[1]對選育自交系和新品種具有重要意義，已成功應用于育種工作[[2]。用此手段育成的卵圓茄“花海茄二號”是一個優質高產卵圓花培品種。茄子花藥培養獲得植株途徑一般有2條，第一，發育胚狀體，直接形成植株；第二，先發育成愈傷組織，愈傷組織上面長生長點發育成植株。通過第一條途徑具有生長周期短，獲得單倍體效率高，有效避免混倍現象，能長期保持高度的分化能力，遺傳上也相對穩定[3]。目前已經有很多種植物通過誘導花藥成功培育出了單倍體植株，如甘藍、煙草等是較易于獲得單倍體的植株，而有些如茄子，番茄等頑拗性植株很難獲得單倍體植株[4]。茄子再生苗發育途徑大多是通過愈傷組織或者愈傷組織再生成胚成苗，而直接通過胚狀體途徑成苗的很少[5]。

研究茄子花藥預處理以及激素種類和配比對茄子胚狀體誘導的影響，建立茄子花藥胚狀體成苗體系，為茄子單倍體育種在生產實踐上提供一定的技術支持，應加強研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試栽培品種15個，編號分別為Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6、Q7、Q8、Q9、Q10、Q11、Q12、Q13、Q14、Q15，均由駐馬店市農業科學院園藝所提供。2017年3月育苗，4月底定植于試驗地。定期疏花疏果，植株保持開花狀態，其他常規田間管理。

表1 供試基因型材料

1.2 方法

1.2.1 材料采集 適于茄子花藥的誘導時期(小孢子多數在單核期靠邊期)，參照張玉苗的研究，采集同一栽培條件下，不同品種的茄子花冠長與花蕾萼基部之差0～2mm[6]的花蕾。

1.2.2 低溫預處理 花蕾放入4℃冰箱中進行低溫預處理，設置處理時間梯度0、1、2、3、4、5、6、7 d選取有效的低溫處理時間。

1.2.3 外植體的消毒和接種 在低溫預處理后的花蕾中倒入75%酒精消毒后立即用0.1%升汞消毒6 min，之后 10 min之內用無菌水沖洗4次。放無菌濾紙上，用茄子剝出花藥進行接種。

1.2.4 高溫處理 花藥接種后在36 ℃下暗培養0、2、4、6、8、10、12 d，選取高溫誘導最高頻率時間；對照為直接放置于25℃黑暗條件下培養，每個處理接種6皿，每皿接種10個花藥，重復3次。

1.2.5 變溫處理 先低溫處理3 d，接種后統一36℃高溫培養2、4、6、8 d，每個處理接種6皿，每皿接種10個花藥，重復3次。

1.2.6基因型的選擇 15個栽培品種花藥接種到MS添加激素2,4-D 0.2 mg·L-1、KT 0.2 mg·L-1的固體培養基上，蔗糖3 %；4℃低溫處理3 d，比較不同品種出胚能力，篩選出胚率最高的品種。

1.2.7 篩選培養基 在基本培養基MS上，分別附加激素濃度梯度組合2,4-D、KT、NAA共19個，蔗糖濃度為3 %，瓊脂6 g·L-1，pH5.8。

1.2.8 胚狀體誘導 將消毒后的花蕾在無菌的條件下接種在同1.2.7的誘導培養基上，每個處理接種10枚花蕾，重復3次，直到出胚。觀察胚狀體產生和分化的條件。

2 結果與分析

2.1 篩選易出胚品種

不同品種的花藥接到MS+2,4-D 0.2 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1上，觀察不同品種出胚率。結果表明，不同基因型材料出胚能力有局限性，在15個基因型品種中只有Q6，Q10具有出胚能力，說明不同品種基因型是影響茄子花藥出胚率的重要因素之一[7]。

2.2 胚狀體產生對溫度的敏感度

2.2.1 胚狀體產生對低溫脅迫的敏感度 將Q6、Q10接種到MS+2,4-D 0.2 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1培養基上，低溫脅迫對茄子花藥培養誘導胚狀體有不同敏感度，不進行低溫脅迫也能誘導出胚狀體，當低溫脅迫3 d時胚狀體誘導率最高，Q6為0.7%，Q10為0.4%，之后有所下降。結果表明，第一，低溫脅迫對茄子花藥胚狀體誘導有一定的敏感度，第二，茄子誘導胚狀體低溫最敏感的時間是脅迫3 d。

圖1 低溫處理對胚狀體誘導率的影響

2.2.2 胚狀體產生對高溫脅迫的敏感度 將Q6、Q10接種到MS+2,4-D 0.2 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1培養基上，結果顯示，高溫脅迫提高了出胚率，且Q6高溫脅迫6d，出胚率達到最高，出胚率為5%。當高溫脅迫天數超過6 d時出胚率急劇下降，12 d時出胚率達到最低，Q10在高溫脅迫4 d時出胚率最高，為8%。研究結果表明，第一，高溫脅迫對茄子胚狀體誘導有所提高；第二，茄子花藥對高溫處理時間較敏感；第三，Q6與Q10高溫脅迫誘導率趨勢保持一致，但是胚狀體誘導頻率最高時間不一致，說明不同品種之間誘導胚狀體高溫脅迫有差異。

圖2 高溫處理對胚狀體誘導率的影響

2.2.3 變溫處理 將Q6、Q10在4 ℃處理3 d后，接種到MS+2,4-D 0.2 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1的培養基上，再36℃高溫處理,研究結果表明，第一，變溫處理出胚率高于高溫處理出胚率，第二低溫處理和高溫處理具有一定的疊加效應。第三，適當的低溫處理能提高胚狀體誘導率。第四，低溫處理(4℃)3 d+高溫(36℃)6 d是胚狀體誘導的最佳溫度和時間，Q6變溫處理的最高出胚率為8.9%，Q10的最高出胚率為11.3%。

圖3 孌溫處理和高溫處理對2個茄子花藥胚狀體誘導率的影響

2.3 胚狀體對激素組合處理的敏感度

由表2看出，茄子胚狀體產生與激素濃度和配比敏感度密切相關， Q6在培養30 d后產生胚狀體，培養10d之后產生綠色分化出子葉的綠苗，移栽成苗。2,4-D 0.2 mg·L-1+KT l mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1的培養基上誘導率最高，為20%，其次是2,4-D 0.2 mg·L-1+KT0.5 mg·L-1的培養基，誘導率為16%。

3 討論與結論

雄核在溫度脅迫下，細胞代謝機制和遺傳表達效應發生改變，發育偏離正常發育途徑[8]，轉向胚狀體發生方向，只有脅迫條件下小孢子胚性化程序才能啟動[9]。低溫脅迫3 d，然后高溫6 d脅迫是胚狀體誘導率最高的時間，Q6變溫處理的最高出胚率為8.9%，Q10的最高出胚率為11.3%。范適在花藥預處理以低溫(4℃)處理4d+高溫(36℃)處理6d的效果最佳[10]，這與前人的結果相似，說明低溫和高溫脅迫對胚狀體產生有疊加效應，經低溫和高溫脅迫達到一定程度后能有效改變花藥內源激素、蛋白質、mRNA、糖類等含量的變化，進而提高小孢子的生活力[11]。

表2 不同濃度激素組合對Q6胚狀體誘導的影響

劉獨臣在茄子花藥誘導胚狀體時，基因型E3低溫處理2 d胚狀體誘導率高達18%[12]，而也有報道在35℃高溫處理2 d獲得了5.1%的胚狀體誘導率[13]。此次試驗中低溫脅迫之后，誘導率3 d之后頻率最高，基因型Q6和Q10的誘導率僅為0.7%和0.4%，高溫處理后，基因型Q6和Q10的胚狀體誘導率在6d之后，胚狀體誘導率最高，分別為5%和8%。在前人的研究中單獨的高溫和低溫處理都能達到較高得胚狀體誘導率，這與前人的研究不一致。這可能是與品種有關，不同品種之間有不同程度的差異。

細胞分裂素和生長素之比反應根和芽的發育，比值高時促進不定芽的分化，反之促進根的形成[14]。2,4-D 0.2 mg·L-1+KT l mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1，這種激素組合濃度產生胚狀體，誘導效率最高為20%。這說明內源激素加外源激素達到一定平衡才能啟動胚狀體誘發的能力。三種激素的組合比兩種激素組合胚狀體誘導率低，有待研究多種激素濃度組合誘導效果。

筆者研究改良了培養條件， Q6和Q10成功獲得了胚狀體，15個品種中，只有Q6，Q10具有出胚能力。花藥產生胚狀體頻率不高，第一，應進一步研究控制花藥培養胚狀體產生的有關數量性狀基因組合，便于尋找更有效的基因型，從根本上利用花藥培養的基因型，促進花藥培養的誘導率。