推拿手法對家兔骨骼肌失神經支配后成肌調節因子Myf-5、Myogenin 表達的影響

盧裕強 郭汝寶

周圍神經損傷是指周圍神經神經干或分支受到損害后，引起軀體感覺障礙、運動功能減退等癥狀的一類病癥，臨床常見、多發[1]。但神經和骨骼肌變性萎縮的機理復雜，目前臨床上對受損神經、肌肉的再生修復缺少有效的治療手段[2]。推拿是中醫重要組成部分之一，有疏通經絡、舒筋止痛等功效，廣泛應用于周圍神經損傷、肌萎縮等疾病，取得較好的臨床效果[3]。本課題組既往研究表明，推拿手法作用于骨骼肌失神經支配模型家兔，可改善患肌的肌電生理及收縮功能，延緩骨骼肌萎縮[4]。本次研究擬通過推拿手法作用于骨骼肌失神經支配家兔，觀察骨骼肌失神經支配后肌組織成肌調節因子中生肌因子5（Myogenic factor 5，Myf-5）、肌細胞生成素（Myogenin）表達水平，研究推拿手法對失神經支配后骨骼肌萎縮修復的可能作用機制，報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 2～3 月齡普通級新西蘭雄性家兔120 只，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供并飼養，每只體質量2～2.5kg，單籠飼養，自由進食，環境溫度20～23℃，濕度30%～100%，光照150～200Lx，噪音小于50dB，許可證號：SCXK（浙）2015-0004。

1.2 試劑與儀器 注射用鼠神經生長因子（201412086，舒泰神生物制藥公司）、Trizol Reagent（15596-026，美國Invitrogen 公司）、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（#K1622，美國Thermo 公司）、FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（04913914001，瑞士Roche 公司）、引物（美國Invitrogen 公 司）。Myf-5引物序列參數：上游5＇-GAGGGTGAGTTTGGGGACGA-3＇，下游5＇-TAGCGGATGGCATTCCTGAG-3＇；Myogenin 引物序列參數：上游5＇-CCACAACCTGCACTCCCTCA-3＇，下游5＇-CAGTTGGGCATGGTTTCATCG-3＇；內參GAPDH 引物序列參數：上游5＇-CGCCTGGAGAAAGCTGCTA-3＇，下游5＇-ACGACCTGGTCCTCGGTGTA-3＇。多樣品研磨珠均質儀（Bead Ruptor 12，美國Omni 公司）、熒光定量PCR 儀（7300，美國ABI 公司）、超凈工作臺（SW-CJ-1FD，蘇州蘇凈安泰公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及模型制備 新西蘭家兔120 只適應性喂養1 周后，按隨機數字表法分為正常對照組、模型對照組、神經生長因子（nerve growth factor，NGF）治療組、手法治療組，每組30 只。為了對檢測指標做一連續動態觀察，以及與本課題組既往研究相延續[4]，每組再隨機分為五個亞組：2 周、3 周、1 個月、2 個月、4 個月組，每個亞組6 只家兔。模型對照組、NGF治療組、手法治療組家兔均進行右后肢脛神經切斷操作，建立腓腸肌失神經支配模型[5]。具體操作：3%戊巴比妥鈉溶液，家兔按0.7mL/kg 體質量，緩慢推注入耳緣靜脈進行麻醉，將家兔在動物手術臺上固定，右后肢剃毛并暴露大腿后部和腘窩。消毒后于膝上股后外側切開小口，暴露并使用玻璃分針鈍性分離脛神經，其后于脛神經上端處切斷脛神經干，且將近端脛神經的游離斷向上折返縫入股二頭肌內。逐層縫合切口后，于切口附近注射青霉素預防感染。左后肢不做任何處理。正常對照組家兔僅于右后肢膝上股后外側做同樣大小切口，暴露脛神經，不做切斷處理，消毒縫合切口同前。

2.2 干預措施（1）手法治療組：推拿干預手法為按揉法，與本課題組既往的規范操作一致[4]。手法的輕重、頻率均需通過FZ-I 型推拿手法測力分析儀標定，專人經訓練之后，于手法組家兔術側腓腸肌上進行操作。具體操作方法：家兔經兔用固定器固定，雙后肢伸出，操作者一手固定其右下肢，暴露腓腸肌部位，另一手置于腓腸肌上，沿著腓腸肌走行，給予按揉手法操作。按揉法的參數：壓力19.6N、頻率140次/min，每次10min，每天1 次，于造模后第4 天開始進行手法干預。（2）NGF 治療組：注射用鼠神經生長因子30μg 溶于2mL 注射用水后，家兔右后肢腓腸肌肌肉注射，于造模后第4 天開始，每天1 次，持續3周。正常對照組及模型對照組同樣使用兔用固定器固定10min，但不進行其他操作。

2.3 指標檢測 各亞組分別在各自對應的造模后第2 周、3 周、1 個月、2 個月、4 個月取材。（1）計算肌濕重比：將家兔過度麻醉后，沿股骨內外髁起點至跟骨結節止點完整剝取雙側腓腸肌，電子天平稱量肌肉濕重，計算術側與健側的比值，即為肌濕重比。（2）實時聚合酶鏈反應（Real-Time PCR）法檢測腓腸肌中Myf-5 mRNA、Myogenin mRNA 表達水平：快速取右后肢腓腸肌肌腹處1.0cm×1.0cm×0.5cm 肌肉組織1塊，冷凍管內保存，液氨速凍后置于低溫冰箱（-80℃）中保存。提取肌組織總RNA（標本排序；加入600μL Trizol 預冷；勻漿加入氯仿混勻；離心；取無機層，加入異丙醇混勻；離心后，棄上清液；用乙醇洗滌沉淀；離心3000r，2min，取沉淀；烘干；溶解RNA 保存），之后逆轉錄cDNA，將制備好的cDNA進行PCR 擴增，并計算Myf-5 mRNA、Myogenin mRNA 的相對表達量。采用儀器自帶軟件（ABI Prism 7000 SDS Software）記錄分析數據。

3 結果

3.1 推拿手法對家兔失神經支配后腓腸肌肌濕重的影響 與正常對照組比較，模型對照組、NGF 治療組、手法治療組家兔各時間點腓腸肌肌濕重比均下降（P＜0.05）。NGF 治療組在造模后第2 周、3 周、1 個月、2 個月，手法治療組在造模后第2 周、3 周、1 個月、2 個月、4 個月時，腓腸肌肌濕重比高于模型對照組（P＜0.05）。手法治療組在造模后第2 周、3 周時腓腸肌肌濕重比低于NGF 治療組，4 個月時則高于NGF 治療組（P＜0.05）。見表1。

3.2 推拿手法對家兔失神經支配后腓腸肌組織Myf-5 mRNA 表達的影響 模型對照組、NGF 治療組、手法治療組家兔各時間點腓腸肌Myf-5 mRNA表達均較正常對照組升高（P＜0.05）。NGF 治療組在造模后第2 周、3 周、1 個月、2 個月，手法治療組在造模后第2 周時，腓腸肌Myf-5 mRNA 表達低于模型對照組；手法治療組在造模后第1、2、4 個月時，腓腸肌Myf-5 mRNA 表達高于模型對照組（P＜0.05）。手法治療組在造模后第3 周、1 個月、2 個月、4 個月時，腓腸肌Myf-5 mRNA 表達高于NGF 治療組（P＜0.05）。見表2。

3.3 推拿手法對家兔失神經支配后腓腸肌Myogenin mRNA 表達的影響 模型對照組、NGF 治療組、手法治療組家兔各時間點腓腸肌Myogenin mRNA 表達均較正常組升高（P＜0.05）。NGF 治療組在造模后第2 周、3 周、1 個月、4 個月，手法治療組在造模后第4 個月時，腓腸肌Myogenin mRNA 表達低于模型對照組，手法治療組在造模后第2 個月時高于模型對照組（P＜0.05）。干預2 周、3 周、1 個月、2 個月后，手法治療組腓腸肌Myogenin mRNA 表達均高于NGF 治療組（P＜0.05）。見表3。

表1 各組失神經支配家兔腓腸肌肌濕重比比較（%，）

表1 各組失神經支配家兔腓腸肌肌濕重比比較（%，）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，△P＜0.05；與NGF 治療組比較，▲P＜0.05；模型對照組、NGF 治療組、手法治療組家兔均進行右后肢脛神經切斷操作，手法治療組進行推拿干預，NGF 治療組肌注注射用鼠神經生長因子；NGF：神經生長因子

表2 各組失神經支配家兔腓腸肌組織Myf-5 mRNA 相對表達量比較（）

表2 各組失神經支配家兔腓腸肌組織Myf-5 mRNA 相對表達量比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，△P＜0.05；與NGF 治療組比較，▲P＜0.05；模型對照組、NGF 治療組、手法治療組家兔均進行右后肢脛神經切斷操作，手法治療組進行推拿干預，NGF 治療組肌注注射用鼠神經生長因子；NGF：神經生長因子；Myf-5：生肌因子5

表3 各組失神經支配家兔腓腸肌組織Myogenin mRNA 相對表達量比較（）

表3 各組失神經支配家兔腓腸肌組織Myogenin mRNA 相對表達量比較（）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，△P＜0.05；與NGF 治療組比較，▲P＜0.05；模型對照組、NGF 治療組、手法治療組家兔均進行右后肢脛神經切斷操作，手法治療組進行推拿干預，NGF 治療組肌注注射用鼠神經生長因子；NGF：神經生長因子；Myogenin：肌細胞生成素

4 討論

失神經支配之后骨骼肌萎縮較迅速，而神經再生較緩慢，往往骨骼肌在神經再支配前已基本喪失細胞再生的物質基礎，導致神經修復后肌肉功能難以恢復[6]。因此，保存失神經支配骨骼肌的再生活性，防止其不可逆變性萎縮，是解決失神經支配骨骼肌重獲神經支配后有效功能康復的重要環節[7]。

研究發現，周圍神經損傷后，局部組織通過推拿手法干預，發生了一系列關節、肌肉的被動運動，一方面促進了局部的淋巴、血液循環，改善組織炎性水腫、瘢痕粘連，從而防止被損傷肌肉、韌帶、關節囊的攣縮[8]；另一方面，通過有規律被動性收縮，局部肌肉興奮，肌組織代謝增強、有害代謝物堆積減少，從而改善失神經后萎縮的骨骼肌組織的代謝過程，同時也促進了一系列肌源性生物活性物質的產生及骨骼肌再生分化，使肌組織纖維化進程得到控制，延緩廢用性萎縮的發生[9-10]。與此同時，骨骼肌再生是一個大量神經生長因子、細胞因子等共同參與的高度動態調控過程，其中NGF 是最早被發現，也是非常典型的一種神經營養因子，是目前臨床上周圍神經損傷后常用的內科治療手段，在臨床及科研上均取得了一定的療效[11-12]，因此本實驗也將NGF 作為手法治療的一個對照。

周圍神經重度損傷后其支配的骨骼肌迅速萎縮并失去收縮功能，最突出的癥狀是肌肉萎縮；肌濕重是實驗中常用于觀察骨骼肌萎縮情況的一項宏觀指標。以往本課題組的研究觀察到，周圍神經切斷損傷后，相關骨骼肌肌濕重迅速出現下降，隨著損傷時間延長而下降速度趨緩[13]。本研究同樣觀察到，與正常對照組相比，模型對照組干預2 周時，腓腸肌肌濕重比已下降顯著（P＜0.05），表明家兔行脛神經切斷術后，腓腸肌失去神經支配，萎縮明顯，達到了我們研究時需要觀察損傷神經修復與萎縮骨骼肌修復兩個方面的需求；3 周后肌濕重比下降趨勢變緩，與既往研究相近。與模型對照組相比，NGF 及手法治療組各時間點肌濕重比值為高（P＜0.05），表明經NGF、推拿手法干預可減輕失神經骨骼肌的萎縮。另一方面，手法治療組4 個月時顯著高于NGF 治療組（P＜0.05），這表明手法治療的遠期療效好于NGF 治療。

肌衛星細胞是骨骼肌再生的關鍵。肌衛星細胞的增殖、激活、成肌分化受到成肌調控因子、生長因子、激素等多因素的影響[14]。其中成肌調節因子由Myogenin、Myf-5、肌分化因子（MyoD）等組成[15]。其中肌衛星細胞的活化、增殖和分化主要受骨骼肌特異性轉錄因子Myogenin 等的調節，與Myogenin 參與成肌細胞融合、形成肌管的過程有關[16-17]。而Myf-5 屬成肌決定因子，位于Myogenin 的上游，主要存在于靜止期的肌衛星細胞，肌組織受損后，靜默狀態的肌衛星細胞開始激活并表達Myf-5，從而促進肌衛星細胞表達并自我激活和相互激活，具體可能與調節肌纖維的生長相關[18]。

本實驗結果表明，骨骼肌失神經損傷后，肌組織的Myf-5 和Myogenin 含量均早期開始升高，表明Myf-5 和Myogenin 早期參與了骨骼肌失神經支配損害后的動態調控，與其他學者研究一致[19-20]。NGF 治療組Myf-5 和Myogenin mRNA 表達在各時間點均低于模型對照組，而肌濕重在中遠期改善均明顯，可能與通過外源性提供NGF 而促進神經軸突生長、神經再支配有關，從而改善肌萎縮相關，與既往他人研究失神經支配后肌組織內NGF 開始顯著下降，通過外源性提供NGF 可改善神經及肌組織功能一致[21]。手法治療組Myf-5 mRNA 在2 周低于模型對照組，第3 周顯著升高，在1、2、4 個月高于模型對照組，表明手法在早期抑制Myf-5 表達，中期開始促進其表達，Myogenin mRNA 在2 個月高于模型對照組，在4個月低于模型組，表明推拿手法可以促進Myogenin mRNA 在后期的表達。而Myogenin 位于Myf5 的下游，既往研究表明，myogenin 表達升高有利于骨骼肌接受神經再支配，在接受神經再支配后骨骼肌功能恢復較良好[22]。結合既往本課題組發現手法治療可促進肌衛星細胞的成肌分化，以及本次手法在早中期改善Myf-5 表達峰期，后期改善Myogenin 表達[23]。這提示手法干預可能使得Myf-5 表達高峰后延且后期持續增高，從而避免肌衛星細胞的早期非神經性無效增殖，而在后期Myogenin 的顯著升高，也更為骨骼肌的再生保留了活力。這種機制與NGF 改善失神經骨骼肌萎縮的機制存在不同，因此也可解釋為何手法組及NGF 組均取得了療效，但對于Myf-5、Myogenin 的改變卻不相同。

綜上所述，推拿手法改善成肌調節因子Myf-5、Myogenin 的表達可能是手法改善失神經支配骨骼肌功能的機制之一，但推拿手法對于延緩肌萎縮的具體作用靶點仍需未來進一步研究。