UPLC法測定白芍浸膏中6種成分

牛 濤，徐 波，陳 紅，張學敏

(天津天士力現代中藥資源有限公司，天津 300410)

養血清腦顆粒是天津天士力制藥股份有限公司研制、生產的國家三類中藥新藥，以宋代中醫名著《太平惠民和劑局方》的“四物湯”為基礎加味并采用最新工藝研制而成的制劑，具有養血活血、平肝潛陽的作用，用于血虛肝亢所致的頭痛、眩暈眼花、心煩易怒、失眠多夢。藥理學研究表明養血清腦顆粒具有改善軟腦膜微循環、增加腦血流量、緩解血管痙攣、止痛等作用[1]。白芍浸膏是養血清腦顆粒和養血清腦丸的制劑中間體，制備工藝為：白芍加適量乙醇溶液提取2次，回收乙醇并濃縮至適量。

白芍來源于毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根。白芍的主要功效為平肝止痛、養血調經、斂陰止汗。與養血清腦顆粒養血平肝、活血通絡的功效相契合，因此，白芍在養血清腦顆粒配方中發揮著重要作用。白芍的化學成分主要為單萜及其苷類、三萜類、芳香酸及其黃酮及其苷類、鞣質類、多糖類、揮發油等[2-3]。我們前期針對白芍浸膏進行了深入研究，建立了白芍浸膏的UPLC色譜分離方法，對主要色譜峰進行了質譜數據分析和對照品比對，確定了6種主要成分，分別為芍藥苷、芍藥內酯苷、五沒食子酰葡萄糖、沒食子酸、苯甲酸和兒茶素[4]。

1 實驗材料

1.1 儀器

Waters Acquity超高效液相色譜儀，TUV紫外檢測器，Empower3化學工作站(美國Waters公司)；AG104電子天平(瑞士 METTLER公司)；Milli-Q超純水處理系統(美國 MILLIPORE公司)。

1.2 試藥

芍藥苷(中國食品藥品檢定研究院，批號100231-200801)；沒食子酸(中國食品藥品檢定研究院，批號111900-200905)；芍藥內酯苷(天津一方科技，批號20150901)；五沒食子酰葡萄糖(天津一方科技，批號20160204)；兒茶素(天津一方科技，批號20160302)；苯甲酸(天津一方科技，批號20160201)、白芍浸膏(天津天士力現代中藥資源有限公司，批號S20160201)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用ACQUITY UPLC HSS T3(2.14 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱，以0.1%磷酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫條件見表1，流速為0.4 mL/min，檢測波長為230 nm。

表1 流動相梯度洗脫條件

圖1 標準品圖譜(a)和白芍提取物圖譜(b)

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取芍藥苷、芍藥內酯苷、五沒食子酰葡萄糖、沒食子酸、苯甲酸和兒茶素對照品適量，加甲醇溶解，制得每毫升含芍藥苷、芍藥內酯苷、五沒食子酰葡萄糖、沒食子酸、苯甲酸和兒茶素分別為0.1 mg、0.04 mg、0.04 mg、0.01 mg、0.001 mg和0.002 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶劑的制備

取白芍浸膏約0.3 g至25 mL量瓶中，精密稱定，加80%甲醇適量，超聲處理20 min(功率150 W，頻率40 kHz)，放冷至室溫，再加80%甲醇至刻度，搖勻，精密量取1 mL，至10 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，即得。

分別取對照品和供試品溶液各2 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，按外標法計算含量。

3 方法學驗證

3.1 線性范圍

精密稱取經沒食子酸、兒茶素、芍藥內酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖和苯甲酸對照品適量，加甲醇配制成每毫升含沒食子酸、兒茶素、芍藥內酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖和苯甲酸對照品適量分別為0.1 mg、0.008 mg、0.04 mg、0.4 mg、0.05 mg和0.05 mg的混合對照溶液，再分別量取0.5、1、2、4、5、10 mL混合對照溶液置于50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，混勻，制成系列溶液，注入液相色譜儀，測定，以濃度對測得的峰面積進行線性回歸，求得回歸方程。結果見表2。

表2 回歸方程、相關系數及線性范圍

3.2 精密度試驗

取上述供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，進樣量2 μL，記錄沒食子酸、兒茶素、芍藥內酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖和苯甲酸的峰面積，峰面積的RSD分別為0.9%、0.1%、1.8%、0.5%、2.1%和0.6%，結果表明精密度良好。

3.3 重復性試驗

精密稱取白芍浸膏6份，按“2.3”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，進樣量2 μL，計算各成分含量。沒食子酸、兒茶素、芍藥內酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖和苯甲酸的平均含量分別為0.62%、0.20%、2.74%、8.53%、2.96和0.10%，RSD分別為1.2%、1.9%、1.1%、1.1%、1.1%和1.8%，表明該方法重復性良好。

3.4 回收率試驗

精密稱取白芍浸膏6份，每份約0.15 g，置25 mL量瓶中，各分別精密加入混合對照品溶液5 mL(每毫升含沒食子酸、兒茶素、芍藥內酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖和苯甲酸分別為0.187 2 mg、0.060 5 mg、0.827 2 mg、2.573 4 mg、0.895 2 mg和0.029 6 mg)，自“加70%甲醇溶液適量，超聲溶解”起，照含量測定項下依法處理，作為供試品溶液，取2 μL注入色譜儀，分別計算沒食子酸、兒茶素、芍藥內酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖和苯甲酸的回收率。結果見表3。

表3 回收率試驗結果 (n=6)

續表3 回收率實驗結果 (n=6)

3.5 穩定性試驗

取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄沒食子酸、兒茶素、芍藥內酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖和苯甲酸的峰面積，峰面積的RSD分別為0.8%、2.3%、1.5%、1.0%、2.8%和2.4%，結果顯示供試品溶液在24 h內穩定性良好。

3.6 樣品含量測定

取不同批次的白芍浸膏，按“2.3”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以外標法計算6種成分的含量。見表4。

表4 樣品含量測定結果 (%)

4 討論

本研究采用超高效液相色譜法(UPLC)進行測定，能夠在5 min內實現6種成分的有效分離，高效快速，穩定性好，靈敏度更高，提高了產品質量控制水平，為產品藥效成分研究提供數據支持[5]。

中藥材和中藥復方成分種類復雜，研究中常會碰到同時測定多個成分且各成分的紫外吸收不同的問題，本研究采用二極管陣列檢測器對測定成分進行了紫外吸收特性分析，通過相似度數據比較，最終確定采用230 nm為檢測波長，能夠很好地兼顧各測定成分。

流動相中加酸可以改善峰形和分離度，比較了相同濃度的甲酸、冰醋酸、磷酸溶液，加入甲酸和冰醋酸后，基線噪音大且有倒峰，加入磷酸則基線平穩，所以選用磷酸。分別試驗了0.05%、0.1%、0.2%的磷酸，結果表明0.1%的磷酸效果最佳。