小秦艽花質量分析研究

孟慶慶，特布新，奧·烏力吉，2*

(1.內蒙古蒙醫藥工程技術研究院，內蒙古 通遼 028000；2.內蒙古民族大學蒙醫藥學院，內蒙古 通遼 028000)

小秦艽花，蒙古文名音譯“呼和-朱力根-其木格”[1]“幫占-奧恩布”[2]，為龍膽科植物小秦艽(GentianadahuricaFisch.)的干燥花，常于夏、秋二季花開放時采收，除去雜質，及時干燥。小秦艽花具有清熱解毒、止咳祛痰的功效，生于草原、山地、草甸、灌叢，分布于我國內蒙古、陜西、甘肅、新疆等地[3]。該藥材較早收載于《無誤蒙藥鑒》《認藥白晶鑒》等經典蒙醫藥著作[4-5]中，現有標準《內蒙古蒙藥材標準》(1986版)除就其【性狀】做了規定外，【鑒別】項下僅有粉末顯微鑒別法；1998年升級載入《中國衛生部藥品標準·蒙藥分冊》，【鑒別】項下增加了黃酮類化合物的一般理化鑒別法，無檢查和含量測定項。因此，提升小秦艽花質量控制方法，確保蒙醫臨床用藥的安全性意義重大。本文建立了小秦艽花的薄層鑒別和含量測定方法，并對小秦艽花進行了水分、灰分、酸不溶性灰分和浸出物等的測定，所建立的方法快速簡便，準確可靠，可行性高，為其質量標準的提升提供了依據。

1 實驗材料

1.1 藥材

7批樣品經內蒙古自治區食品藥品檢驗所原蒙藥室主任康雙龍，內蒙古農業大學林學院教授額日敦·嘎日迪，內蒙古民族大學蒙醫藥學院教授布和巴特爾，內蒙古民族大學蒙醫藥學院教授吳香杰，內蒙古蒙醫藥工程技術研究院特聘專家白明剛，通遼市食品藥品檢驗所中蒙藥室主任安文遠鑒定，均為GentianadahuricaFisch.的干燥花。樣品采集信息見表1。

表1 小秦艽花樣品采集信息

1.2 儀器

Alliance e2695高效液相色譜儀(Waters)；Mettler Toledo NewClassic MS105電子天平 d=0.01 mg[梅特勒-托利多儀器(上海)]有限公司；娃哈哈飲用純凈水(山東省濟南市)；KQ-600DB數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BS224S電子天平(北京賽多利斯科學儀器系統有限公司)；SQP電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]。

1.3 試藥

異葒草苷對照品(含量測定用，批號111974-201401，中國食品藥品檢定研究院)；聚酰胺薄膜(薄層層析用，天津思利達科技有限公司)；甲醇為色譜級(天津星馬克科技發展有限公司)；水為娃哈哈飲用純凈水；磷酸、甲醇、乙醇等所用試劑均為分析純(天津市永大化學試劑有限公司)。

2 實驗方法與結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液制備 取本品粉末0.5 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液制備 取異葒草苷對照品，加甲醇制成每l mL含0.3 mg異葒草苷的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3 薄層色譜鑒別 按照《中國藥典》(2015年版四部通則0502)薄層色譜法試驗[6]，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以展開劑：①甲醇-水-冰醋酸(6∶1∶1，使用量×2=16 mL)；②乙醇-水-冰醋酸(4∶1∶1，使用量×2=12 mL)；③丙酮-水-冰醋酸(3∶1∶1，使用量×3=15 mL)，將不同產地7批次小秦艽花供試品溶液進行展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鋁試液，置于紫外光燈(254 nm)下檢視。結果三個展開系統的供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，均顯相同顏色的斑點；斑點Rf值適宜，顯色清晰，色譜分離好。尤以展開劑甲醇-水-冰醋酸(6∶1∶1)更佳，且信息量多，故用于耐用性考察。結果見圖1。

2.1.4 耐用性考察 吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，展開條件為A.室溫展開(T=25 ℃，RH=5%)；B.冰箱冷藏室展開(T=5 ℃)；C.點樣板RH75%(氯化鈉過飽和溶液控制)預平衡30 min后，室溫展開；D.點樣板RH20%(醋酸鉀過飽和溶液控制)預平衡30 min后，室溫展開，按上述方法顯色檢視。結果見圖2。

A.甲醇-水-冰醋酸(6∶ 1∶1)B.乙醇-水-冰醋酸(4∶ 1∶1)C.丙酮-水-冰醋酸(3∶1∶1)

A.室溫展開(T25 ℃，RH5%)；B.冰箱冷藏室展開(T5℃)；C.點樣板RH75%預平衡30 min后，室溫展開；D.點樣板RH20%預平衡30 min后，室溫展開

2.2 檢查

2.2.1 水分測定 按照《中國藥典》2015年版四部通則0832水分測定法第二法[6]，對7批藥材的水分進行考察。結果7批小秦艽花水分為4.64%～5.27%，平均值為4.93%。

2.2.2 灰分測定法、酸不溶性灰分 照《中國藥典》2015年版四部(通則2302)灰分測定法[6]，對7批樣品的總灰分及酸不溶性灰分進行了考察測定。結果7批小秦艽花總灰分為4.68%～9.64%，平均值為6.53%，酸不溶性灰分為0.70%～4.56%，平均值為2.16%。

2.2.3 重金屬檢查 對本品中的重金屬含量進行了限量考察。參照有關文獻(CHP2005I/阿膠)，取本品內容物1.00 g，按照《中國藥典》2015年版四部(通則0821)重金屬檢查法第二法依法操作檢查[6]。結果每批樣品每1 g內容物中的重金屬含量均少于10 μg，即均低于百萬分之十。

2.2.4 砷鹽檢查 對本品中的砷鹽含量進行了限量考察。參照有關文獻(CHP2005I/阿膠)，取本品4.0 g，加無砷氫氧化鈣2 g，混合，加少量水，攪勻，干燥后先用小火燒灼使碳化，再在500～600 ℃熾灼使完全灰化，放冷，加鹽酸4 mL與適量的水使溶解成50 mL，分取溶液12.5 mL，加鹽酸4 mL與水11.5 mL，按照中國藥典2015年版四部(通則0822)砷鹽檢查法第一法[6]，標準砷對照液的制備，自“再加碘化鉀試液5mL”起，依法操作[8]。結果7批次供試品中，每1 g內容物中的砷鹽含量均少于2 μg，即均低于2%。

2.3 浸出物

按照醇溶性浸出物測定法(《中國藥典》2015年版四部通則2201)項下的熱浸法測定[6]，用75%乙醇做溶劑，結果7批小秦艽花浸出物為32.22%～40.85%，平均值為36.81%。

2.4 含量測定

按照高效液相色譜法(通則0512)測定[6]。

2.4.1 色譜條件 色譜柱為XSelect HSS T3(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相為甲醇-0.04%磷酸溶液(33∶67)；檢測波長為350 nm；流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.4.2 對照品溶液制備 取異葒草苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含異葒草苷0.1604 mg的溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液制備 取本品粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇10 mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4.4 測定方法 精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中，在與對照品色譜相應的位置有異葒草苷的吸收峰。結果見圖1、圖2。

圖3 異葒草苷對照品HPLC色譜

圖4 小秦艽花供試品HPLC色譜

2.4.5 線性關系考察 精密吸取濃度分別為0.032 08、0.064 16、0.096 24、0.128 32、0.160 4 mg/mL的異葒草苷對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積值。并以進樣量C(x)對峰面積值A(y)進行線性回歸，得標準曲線回歸方程為：y=27 032 644.20x-21 098.74，相關系數r=1.00。結果異葒草苷進樣量在0.320 8～1.604 μg范圍內，與峰面積值具有良好的線性關系，相關性顯著。

2.4.6 精密度試驗 取同一濃度的異葒草苷對照品溶液，在24 h內重復進樣6次，測定異葒草苷的峰面積，計算峰面積RSD為0.23%。結果表明日內精密度良好。

2.4.7 穩定性試驗 分別于第0、2、4、8、12、24 h，精密吸取X4(批號20170828)供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積值。結果其RSD為0.87%。表明供試品溶液在24 h內測定穩定性良好。

2.4.8 重復性試驗 精密稱取樣品X4(批號20170828)，按照“2.4.3”項下方法制備供試品溶液6份，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積值，并計算含量。結果其RSD為1.61%。表明該方法具有良好的重復性。

2.4.9 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品X4(批號20170828；含量0.15%)約0.25 g，共9份，精密稱定，分三組，按樣品中含量-對照品加入量1∶0.5、1∶1、1∶1.5的要求分別依次精密加入異葒草苷對照品儲備液(0.160 4 mg/mL)適量，按照“2.4.3”項下方法操作，制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，測定，并計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果

回收率試驗結果符合藥品質量標準分析方法驗證指導原則(中國藥典2015年版四部通則9101)[6]規定(待測定成分含量0.1%，回收率限度90%～108%)，表明本試驗所采用的測定方法結果準確、可靠，可用于小秦艽花的含量測定。

2.4.10 不同產地樣品含量測定 取小秦艽花樣品約0.5 g，精密稱定，分別按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，測定，并計算含量。結果見表3。

表3 不同產地樣品含量測定結果

3 討論

取異葒草苷對照品溶液，按照高效液相色譜法(中國藥典2015年版四部通則0512)，在200～400 nm波長范圍內進行光譜掃描，結果在350 nm處有最大吸收，故測定波長確定為350 nm。

曾首選所含龍膽苦苷作為定量控制小秦艽花質量的特征指標成分，進行了高效液相色譜法測定其含量的研究[7]。結果因含量比異葒草苷低，故參考文獻選擇本品所含異葒草苷作為定量控制本品質量的特征指標成分，按照“中藥質量標準分析方法驗證指導原則”要求，進行了高效液相色譜法測定小秦艽花中異葒草苷含量的研究[8]。結果該方法簡便、快捷、準確、重復性好。

溶劑濃度考察方面，樣品取6份，依次加入60%～85%的甲醇溶劑，按提取方法處理，測定其含量。結果表明75%甲醇提取液含量較高，故提取溶劑乙醇濃度選定75%。

提取時間考察方面，取4份樣品，精密加入溶劑，依次超聲處理(功率500 W，頻率4 0kHz)10 min、20 min、30 min、40 min(其余步驟按提取方法處理)，結果表明平均提取量為0.140 5%，RSD為1.88%，差異明顯。故采用超聲30 min提取。

色譜系統性試驗考察方面，取已知含量的樣品X4(批號20170806)約0.5 g，主要采用兩種色譜柱XSelect HSS T3(5 μm，4.6 mm×250 mm)，Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6 mm×25 0 mm)；測定小秦艽花中異葒草苷的含量，結果無顯著性差異，RSD為1.79%、0.70%。

綜上所述，該實驗所采用的測定方法簡便，結果準確、可靠，重復性好，可用于樣品測定，為小秦艽花的研究提供了參考依據。