葛根散對酒傷ED大鼠陰莖平滑肌組織β-catenin mRNA及蛋白表達的影響

張琪其，楊曉筱，羅仕艷，王慶學

(貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025)

傳統中醫將因不合理的飲酒而產生的身體傷害稱為“酒傷”。現代醫學中，“酒傷”涵蓋了由于飲酒不當導致機體產生的多系統疾病[1]。其在生殖系統主要表現為ED，即陰莖持續不能達到或維持足夠的勃起進行滿意性交達3個月以上，且隨當代社會人群飲酒量的增加，其發病率日益增加，對患者身心健康都有很大的負面影響。據統計，目前中國40歲以上男性ED的患病率約為40.56%[2]。預計全球在2025年約有3.22億ED患者[3]，酒傷所致ED將占相當比重。ED的發病機制復雜，其中陰莖海綿體平滑肌(corp-us cavernosum smooth muscle，CCSM)結構與功能不健全是其發生的一個重要因素。陰莖海綿體平滑肌細胞(CCSMCs)是構成CCSM的基本單位，也是保障CCSM結構與功能健全的基本單位。陰莖的勃起依賴CCSMCs快速協同一致興奮舒縮而產生，縫隙連接(gap junction，GJ)被認為是維持這種整體協調性的結構基礎，構成陰莖海綿體平滑肌縫隙連接的主要連接蛋白是連接蛋白43(connexin43，Cx43)[4]。有研究發現，Cx43基因與蛋白的表達可明顯被β-catenin干預[5]。β-catenin在機體多種組織細胞中均有表達，如平滑肌細胞、成骨細胞、成纖維細胞等，既可作為一種細胞骨架蛋白存在于細胞膜，同時在細胞質和細胞核中也有表達。可通過介導細胞間黏附、以轉錄因子形式調控基因與蛋白的表達，從而調節細胞增殖、分化和調亡[6]。經典解酒方——葛根散有防治飲酒過度所造成的酒毒內蘊之功效，現代醫學研究發現，此方在治療酒傷大鼠ED方面亦有較為明顯的效果，可以顯著增加酒傷雄性大鼠追逐雌性大鼠次數、預防或修復酒傷大鼠睪丸組織病理損傷[7]。本實驗旨在探討葛根散對酒傷ED大鼠陰莖平滑肌組織β-catenin mRNA及蛋白表達的影響，進一步了解葛根散治療酒傷ED的具體作用機制，為中醫藥治療酒傷ED提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級SD雄性大鼠35只，體重(180±20)g，購自貴州中醫藥大學實驗動物中心[許可證號：SCX(黔)20020001)]。

1.2 主要試劑與儀器

56%紅星二鍋頭白酒(北京紅星股份有限公司，批號100809)；Animal Total RNA lsolation Kit(FOREGENE公司，批號RE-03014)；RT EasyTM II(First-strand cDNA synthesis for Real Time PCR)(FOREGENE公司，批號RT-01023)；Real Time PCR EasyTM(FOREGENE公司，批號QP-01014)；ZS-2型板式酶標儀(北京市新風機電技術公司)BCA蛋白定量試劑盒(江蘇康為世紀公司，批號：CW0014)；PIKORed 96型實時熒光定量儀(型號：RT-PCR，美國ThermoFisher儀器有限公司)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(江蘇康為世紀公司，批號：CW0022)；Wester blotting ladder pen(江蘇康為世紀公司，批號：CW2502)；ECL高靈敏度化學發光檢測試劑盒(江蘇康為世紀公司，批號：CW0049)；EPS-300型電泳儀(美國BIO-RAD公司)；Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System蛋白電泳槽(美國BIO-RAD公司)；Mini Trans-Blot蛋白轉印系統(美國BIO-RAD公司)；抗β-Actin鼠單克隆抗體(江蘇康為世紀生物公司，批號：CW0096A)；抗β-Actin兔多克隆抗體(江蘇康為世紀生物公司，批號：CW0097A)；β-catenin(美國Proteintech公司，批號：51067-2-AP)；ChemiDocTM XRS+化學發光凝膠成像系統(美國BIO-RAD公司)。

1.3 實驗藥材

葛根散(金·張子和《儒門事親》)：由葛花、甘草、葛根、砂仁、貫眾等組成。組方藥材購自貴州中醫藥大學第一附屬醫院，按原方比例常規制備水煎劑(調整生藥濃度為1 g·mL-1)備用。

1.4 動物分組、造模及給藥

健康清潔級雄性SD大鼠，共35只，每組7只，隨機分成5組，即：空白組，模型組，葛根散低、中、高劑量組(0.05 g·10 g-1、0.1 g·10 g-1、0.2 g·10 g-1)。空白組以等量生理鹽水灌胃，模型組和葛根散低、中、高劑量組以紅星二鍋頭白酒按1.5 mL·100 g-1·d-1灌胃。每天灌酒30 min后，葛根散低劑量組、葛根散中劑量組、葛根散高劑量組以不同濃度的葛根散水煎劑灌胃，空白組和模型組代以等量生理鹽水，連續30 d。最后一次灌胃2 h后，處死并摘取大鼠陰莖。

1.5 RT-PCR法檢測葛根散對酒傷ED大鼠陰莖平滑肌組織β-catenin mRNA表達的影響

按照超純RNA試劑盒說明從大鼠陰莖平滑肌組織制備總RNA，分光光度計測定總RNA濃度和純度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，按cDNA反轉錄試劑盒說明進行逆轉錄。PCR擴增條件為95 ℃預變性30s，95 ℃變性5s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸30 s，循環次數45個。目的基因作為引物和以GAPDH作為內參基因，引物列為GAPDH，上游引物序列5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′，下游引物序列5′-CCACCCTGTTGCTGTAGCCATA-3′，擴增產物長度270bp；β-catenin上游引物序列5′-GCCAGTGGATTCCGTACTG-3′，下游引物序列5′-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-3′，擴增產物長度202bp。實驗重復3次，擴增結束后計算擴增效率，并計算β-catenin基因的相對表達水平

1.6 Western Blot法檢測葛根散對酒傷ED大鼠陰莖平滑肌組織β-catenin蛋白表達的影響

按組織蛋白提取試劑盒說明進行蛋白提取，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，將制備好的蛋白樣品加入10%的凝膠中電泳，轉膜，取膜，將其加入封閉液中，保持20 min，用蒸餾水將一步法試劑盒中的10×洗液稀釋成1×洗液；取二抗HRP至4 mL離心管中，再取一抗與二抗混勻，室溫孵育5 min，加入一步法抗體稀釋液。其中，一抗β-catenin濃度(1∶1 000)，二抗β-catenin濃度(1∶200)，一抗內參β-actin濃度(1∶5 000)，二抗內參β-actin濃度(1∶200)，傾去抗體混合液，用洗液漂洗3次，5 mL×5 min。ECL顯色曝光，分析結果。

1.7 統計分析

2 結果

2.1 RT-PCR法檢測葛根散對酒傷ED大鼠陰莖平滑肌組織β-catenin mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組β-catenin mRNA表達水平顯著下降(P<0.05)。與模型組比較，葛根散中、高劑量組β-catenin mRNA表達水平顯著上升(P<0.05)。見表1。

組別濃度(g·10g-1)β-cateninmRNA正常組-1.08±0.05模型組-0.37±0.13*葛根散低劑量組0.050.49±0.15*葛根散中劑量組0.10.61±0.11*#葛根散高劑量組0.20.72±0.21*#

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 Western Blot法檢測葛根散對酒傷ED大鼠陰莖平滑肌組織β-catenin蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組β-catenin蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)。與模型組比較，葛根散低、中、高劑量組β-catenin蛋白表達水平顯著上升(P<0.05)。且葛根散高劑量組β-catenin蛋白相對表達水平與正常組比較無統計學差異(P>0.05)。見表2、圖1。

組別濃度(g·10g-1)β-catenin蛋白正常組-0.73±0.10模型組-0.24±0.03*葛根散低劑量組0.050.36±0.06*#葛根散中劑量組0.10.46±0.05*#葛根散高劑量組0.20.53±0.09#

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

注：A正常組；B模型組；C葛根散低劑量組；D葛根散中劑量組；E葛根散高劑量組

圖1 葛根散對酒傷ED大鼠陰莖平滑肌
組織β-catenin蛋白條帶

3 討論

隨著社會經濟不斷發展及生活方式的變化，我國成年男性人群ED發病率持續升高[8]。CCSM是維持陰莖勃起的重要結構，研究表明，當CCSM舒張時，血液灌注、回流受阻，陰莖勃起；當CCSM收縮時，血液回流，陰莖處于松弛狀態。組成CCSM的CCSMCs作為保障CCSM結構與功能的基本單位，其增殖、分化和凋亡對陰莖能否正常勃起有重要意義。Cx43是CCSMC細胞之間信號通訊的主要連接蛋白[9，10]，是CCSMCs相鄰細胞信息交流的主要通道，對協調CCSMC同步舒縮意義重大。而β-catenin廣泛存在于各種類型的細胞中，由CTNNBl基因編碼，參與細胞間蛋白的轉錄及活性的調控。當受到細胞因子激活后，β-catenin進入細胞核內，細胞間蛋白隨β-catenin的表達增多而增多。有研究表明，β-catenin還具有促進細胞增殖與分化之功效，如促血管平滑肌細胞增殖[11]。

葛根散出自金代張子和所著《儒門事親》，由葛花、甘草、葛根、砂仁、貫眾組成，有利濕健脾、散毒解酒的功效[12]。葛根散主治飲酒過度、酒毒內蘊者，即從根本上清除酒熱濕毒，補益肝腎。現代藥理研究表明，此方劑中葛花所含成分皂角苷具備氧化還原的作用，可以促進乙醇氧化而保護胃腸黏膜，同時減緩酒精吸收入血而降低酒精濃度[13]。此方劑酒前服用或酒后服用均有效，可有效緩解因飲酒不當導致的不適癥狀。

前期研究發現葛根散可以減輕或修復酒傷大鼠睪丸組織病理損傷，可以在一定程度上改善雄性酒傷大鼠的性欲[7]。本實驗結果顯示，與正常組比較，模型組β-catenin mRNA及蛋白表達水平顯著下降。與模型組比較，葛根散中、高劑量組β-catenin mRNA表達水平顯著上升，葛根散低、中、高劑量組β-catenin蛋白表達水平顯著上升。且葛根散高劑量組β-catenin蛋白相對表達水平與正常組比較無統計學差異。因此，葛根散治療酒傷ED的機制之一可能與上調β-catenin mRNA及蛋白表達水平，進而提高Cx43蛋白表達水平有關[14]。加強CCSMCs細胞間聯系，為酒傷ED患者的臨床治療提供了理論依據。β-catenin是否能促進CCSMCs增殖與分化，通過增加CCSMCs細胞數量以改善陰莖勃起功能，還有待于進一步研究。