獨活寄生湯含藥血清對大鼠退變軟骨細胞TLR4/NF-κB信號通路的影響

吳廣文，邱建清，劉淑如，陳 俊

(1.福建中醫藥大學 中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學 中西醫結合學院，福建 福州 350122)

膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是影響中老年人生活質量的常見病，目前KOA發病機制尚未完全明確，現代醫學從組織形態學、生物化學及分子生物學等方面對其發病機制展開研究，認為KOA是在力學和生物學等因素共同作用下導致軟骨細胞、細胞外基質及軟骨下骨三者降解和合成正常偶聯失衡的結果[1]。炎癥反應介導的軟骨細胞凋亡、軟骨基質降解是引起KOA軟骨退變的關鍵因素，在KOA病理過程中發揮重要作用[2]。前期研究發現TLR4/NF-κB信號通路異常激活將引起下游效應產物炎癥因子過表達，在關節炎發病過程中具有重要作用[3-8]，中醫藥可有效調節TLR4/NF-κB信號通路表達[9-10]。

獨活寄生湯出自孫思邈《備急千金要方》，廣泛用于KOA的治療，療效可靠[11-16]。前期研究表明，獨活寄生湯可有效延緩軟骨退變[17-23]，但是否通過調節TLR4/NF-κB信號通路，尚不明確。因此，研究以SD大鼠退變軟骨細胞為研究平臺，通過觀察獨活寄生湯含藥血清對TLR4/NF-κB信號通路的影響，探討獨活寄生湯治療KOA的作用機制，為其臨床應用提供依據。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物

2月齡SPF級雄性SD大鼠36只，4周齡SPF級SD大鼠20只(購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號：SCXK(滬)2017-0005)。

1.2 主要試劑與儀器

一抗TLR4、MyD88和TRAF6(美國abcam公司)；一抗NF-κB p65(美國cell signaling公司)；二抗(美國Millipore公司)；誘導型一氧化氮合酶(iNOS)檢測試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒、白介素-6(IL-6)檢測試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司)；TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65引物(福州尚亞生物技術有限公司)；酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司)；蛋白核酸分析儀(美國Beckman Coulter公司)；ABI 7500實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 血清制備

將36只SD大鼠隨機分為含藥血清組和空白血清組，每組18只。根據藥理試驗中動物與人體間的等效劑量換算關系[24]，含藥血清組按照9.3 g·kg-1給予獨活寄生湯灌胃，空白血清組給予等量生理鹽水灌胃，每天1次。連續灌胃7 d，10%水合氯醛麻醉后行腹主動脈采血，離心獲取獨活寄生湯含藥血清和空白血清，56 ℃水浴滅活30 min，-20 ℃保存備用。

2.2 退變軟骨細胞造模及藥物干預

參照課題組前期取材方法，采用10%水合氯醛腹腔麻醉后，頸椎脫臼處死大鼠，75%酒精浸泡5 min，游離并截取膝關節，置入無菌培養皿，帶入超凈工作臺操作。先用PBS充分漂洗，刮除關節周圍附著的肌肉、脂肪、骨膜、滑膜等組織后再次用PBS充分漂洗。用刀片削取每個關節表面的軟骨，PBS充分漂洗3次，采用酶消化法消化，獲取軟骨細胞[25]。培養、傳代至第3代，用10 ng·mL-1IL-1β干預24 h，獲得退變軟骨細胞[26-27]。將退變軟骨細胞分為兩組：模型組(參照以往研究結果[17]，用含10%空白血清的培養基干預)和治療組(參照以往研究結果[17]，用含10%獨活寄生湯含藥血清的培養基干預)，干預24 h后進行相關指標檢測。

2.3 ELISA檢測各組iNOS、TNF-α和 IL-6含量

干預結束后，吸取細胞培養液上清，保存于離心管中。消化、收集細胞，加入保存的細胞培養液上清，重懸細胞，1 000 g離心5 min，棄上清。PBS洗滌細胞2次。加入PBS重懸細胞，超聲處理細胞懸液。-20 ℃反復凍融3～5次。4 ℃，1 000 g離心5 min，取上清。參照試劑盒說明書測定各組樣品iNOS、TNF-α和 IL-6含量。

2.4 Real-time PCR法檢測各組細胞中TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65 mRNA表達

干預結束后，采用Trizol法提取各組細胞總RNA；核酸分析儀檢測各樣本RNA濃度(μg/μL)和OD260/280值。根據TAKARA逆轉錄試劑盒說明書，取1 μg總RNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃。以1 μL·cDNA為模板擴增TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65和GAPDH。擴增反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以GAPDH為內參照基因，計算各目的基因2-ΔΔCt，比較分析各目的基因mRNA表達水平。目的基因引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列

2.5 Western blot法檢測各組細胞中TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65蛋白表達

干預結束后，提取各組總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，每孔按照30 μg上樣，SDS-PAGE凝膠電泳；采用濕轉轉膜；室溫封閉1 h后；一抗(TLR4，1∶1 000；MyD88，1∶1 000；TRAF6，1∶1 000；NF-κB p65，1∶1 000；β-actin，1∶2 000)，4 ℃孵育過夜；次日分別用羊抗兔或抗小鼠抗體室溫孵育1 h；參照ECL化學發光試劑盒說明書，凝膠成像儀下顯影、拍照。

2.6 統計學分析

3 結果

3.1 獨活寄生湯含藥血清對iNOS、TNF-α和 IL-6水平的影響

與模型組相比，治療組iNOS、TNF-α和IL-6含量均降低，差異具有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

注：與模型組比較，*P<0.01，**P<0.05。

3.2 獨活寄生湯含藥血清對TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65 mRNA表達的影響

與模型組相比，治療組中TLR4表達降低到(0.648±0.064)，MyD88表達降低到(0.692±0.051)，TRAF6表達降低到(0.612±0.010 5)，NF-κB p65表達降低到(0.734 2±0.084 8)，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：與模型組比較，*P<0.01；**P<0.05。

3.3 獨活寄生湯含藥血清對TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65蛋白表達的影響

獨活寄生湯含藥血清對退變軟骨細胞TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65蛋白表達的影響與其對TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65 mRNA的影響具有類似的趨勢。與模型組相比，治療組中TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65蛋白表達均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：與模型組比較，*P<0.01；**P<0.05。

4 討論

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種多見于中老年人的骨關節疾病，發病率隨年齡增長而增加[28]，其病程特點是易反復發作、纏綿難愈，具有較高的致殘率，嚴重影響患者的生活質量[29]，治療方法雖多，但主要以對癥治療為主，其防治已成為醫學界研究的難點問題之一。軟骨退變是OA最主要的病理變化，是多因素綜合作用的結果。軟骨細胞是軟骨中的唯一細胞，分散于細胞外基質中，對維持軟骨的完整性以及軟骨的負重功能具有重要作用。在OA中，炎癥因子會通過細胞內的信號轉導途徑將信號傳遞給各種轉錄因子，從而介導軟骨細胞的分化，誘導軟骨細胞表型變為成纖維細胞表型，促使關節中的軟骨細胞凋亡，周圍組織纖維化[30]。因此，如何有效抑制炎癥反應對軟骨的破壞，將成為治療OA的重要途徑。本研究檢測了退變軟骨細胞中炎癥相關因子iNOS、TNF-α和IL-6含量，結果發現經過獨活寄生湯含藥血清干預后，iNOS、TNF-α和IL-6含量均降低，提示獨活寄生湯含藥血清可通過有效抑制退變軟骨細胞中iNOS、TNF-α和IL-6含量，抑制OA炎癥反應，最終達到緩解OA之目的。

NF-κB是一種與炎癥因子產生、細胞增殖、細胞外基質交聯和細胞凋亡密切相關的轉錄因子，參與多種炎癥的信號轉導[31]，在細胞中最常見的作用形式為NF-κB p65及NF-κB p50。未受刺激時結合在一個或幾個抑制性的κB蛋白(IκB)上，形成NF-κB/IκB復合物，以非活化形式存在。IκB不僅阻止NF-κB的核內轉錄，也阻止其在胞質與核內的穿梭。IκB的活性又被IκB激酶(IκB kinases，IKK)控制。當細胞受到促炎因子等刺激，會激活IKK使IκB磷酸化，IκB磷酸化后發生泛素化，引起IκB水解，釋放NF-κB，進一步調節NF-κB依賴的基因表達[32]，如iNOS、TNF-α、IL-6和IL-8等，進而對細胞損傷、炎癥等起到一定的促進作用。本研究采用Real-time PCR方法，從基因層面檢測退變軟骨細胞中NF-κB p65 mRNA表達，結果發現經過獨活寄生湯含藥血清干預后NF-κB p65 mRNA表達量明顯下降。進一步采用Western blot方法，從蛋白層面檢測退變軟骨細胞中NF-κB p65蛋白表達，發現獨活寄生湯含藥血清干預后NF-κB p65蛋白表達量明顯下降，與NF-κB p65基因變化趨勢一致。基于以上研究結果，考慮獨活寄生湯含藥血清可能是通過調節NF-κB信號通路，進而調節iNOS、TNF-α和IL-6表達，但NF-κB信號通路是否是唯一通路，需要后期進一步研究證實。

TLR的亞型TLR4是重要的信號通路轉導蛋白，它與OA發病機制密切相關，高表達于OA軟骨細胞中，參與軟骨破壞[33-34]。TLR4能夠識別病原相關分子模式PAMP及其他輔助受體結合形成的受體復合物信號轉導，可誘發炎性因子表達，引發炎性反應[35]。TLR4信號通路可分為MyD88依賴性信號通路和MyD88非依賴性信號通路[36]。TLR4結構域與MyD88的同源結構域相結合，活化MyD88，進而引起IRAK的自磷酸化[37]，磷酸化的IRAK與腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)相互作用形成復合物，促使NIK活化，進而活化IKK，降解IκB，并釋放轉錄因子NF-κB(如NF-κB p65)，由胞質轉位到核內，刺激各種細胞因子等的表達[38-40]。本研究采用Real-time PCR方法，從基因層面檢測退變軟骨細胞中TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA表達，發現經過獨活寄生湯含藥血清干預后TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA表達量均明顯下降。進一步采用Western blot方法，從蛋白層面檢測退變軟骨細胞中TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達，發現獨活寄生湯含藥血清干預后TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達量均明顯下降。基于以上研究結果，考慮獨活寄生湯含藥血清可能是通過調節TLR4、MyD88、TRAF6，進而調控NF-κB信號通路表達，但其是否是唯一途徑，需要后期進一步研究驗證。

5 結論

獨活寄生湯可能是通過調控TLR4/NF-κB信號通路，進而調節炎癥相關因子iNOS、TNF-α和IL-6表達，起到治療骨關節炎的作用。