延胡索總生物堿滴丸對犬急性心肌缺血模型心肌酶譜影響

康天濟，賈靜麗，田冰，賈永囡，田明，鄭超，劉楊，季宏與

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

心肌缺血是由于心臟冠狀動脈血液灌注減少，心肌細胞供氧不足，能量代謝失衡，不能維持心肌正常生理機能而出現的病理狀態。冠心病是嚴重危害人類健康的臨床常見病。中藥延胡索具有擴張冠脈血管、提高冠脈流量、對心肌缺血、壞死有保護所用[1]，延胡索總生物堿滴丸是其提取精制濃縮的總生物堿有效部位的制劑。本實驗對延胡索總生物堿滴丸進行藥效學研究，觀察其對實驗犬急性心肌缺血、心肌梗死的保護作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

比格犬，健康成年，體質量12～16 kg，雌雄兼用。由沈陽康平實驗動物研究所提供。

1.2 實驗藥物及儀器

延胡索總生物堿滴丸(規格：35 mg/粒，每粒含延胡索總生物堿5 mg。自制);復方丹參滴丸(規格：每丸重27 mg，批號：Z1095011。天士力制藥集團股份有限公司);P11011戊巴比妥納(Pentobarbital sodium sat)(百杰斯生物公司);枸櫞酸鈉(惠氏生化有限公司)EDTA-K2 一次性使用真空采血管2 mL;32% 檸檬酸鈉 一次性真空采血管2 mL;肝素鈉一次性真空采血管5 mL(江蘇康捷醫療器械有限公司);BL-420生物機能試驗系統(成都泰萌科技有限公司);AthlonX GLAMOUR2000全自動生化分析儀AMD(美國MD公司)。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組及給藥方法

取健康成年的實驗動物比格犬20只，體質量均在12～16 kg，隨機分成5組，每組4只，即(1)模型對照組，(2)延胡索總生物堿滴丸劑高劑量組，(3)延胡索總生物堿滴丸劑中劑量組，(4)延胡索總生物堿滴丸劑低劑量組，(5)丹參滴丸陽性對照組。

模型對照組給予3 mL/kg的生理鹽水，延胡索總生物堿滴丸劑高、中、低劑量組和丹參滴丸陽性對照組的給藥劑量，均按人和狗間體表面積的等效劑量比折算成等效劑量后，按等效劑量的16、8、2、2設置梯度，即延胡索總生物堿滴丸劑高、中、低劑量組和丹參滴丸陽性組給藥劑量分別為：222.0 mg/kg、111.9 mg/kg、27.9 mg/kg、67.2 mg/kg；將延胡索總生堿滴丸劑實驗組和丹參滴丸實驗組給藥劑量，溶于生理鹽水，配成至所需濃度，混勻即可。各組實驗動物均在冠脈結扎30 min后，經十二指腸給藥，給藥體積為3 mL/kg。

2.2 犬急性心肌缺血模型的造模方法

上述5組實驗動物，每只實驗動物分別稱重，用戊巴比妥納(30 mg/kg)靜脈注射麻醉后，將犬仰臥并固定于保溫手術臺上。

首先在腹股溝區切開長約2～3 cm的皮膚，分離剝露出股動脈和股靜脈，股動脈遠心端結扎成死結，近心端用止血鉗夾緊，插入帶有三通閥的無菌聚乙烯管，手術線結扎固定，三通閥的一端連結壓力換能器，壓力換能器的另一端連結用BL-420生物機能實驗系統。旋轉三通閥，用BL-420生物機能實驗系統，測定動脈血壓；股靜脈按股動脈插管方法插入聚乙烯管，放開動脈夾，三通管的一端連結生理鹽水通道，旋轉三通閥，建立生理鹽水靜脈滴住通道，給予生理鹽水滴住，防止失液過多，電解質紊亂。

在沿著腹部正中線切開上腹部皮膚，掏出十二指腸，在十二指腸上剪開一小口，插入橡膠軟管，進行荷包式縫合，以備給予實驗動物受試藥物。

切開頸部皮膚，分離氣管，進行氣管剪口插管，接動物呼吸機，進行人工呼吸，呼吸頻率16～18次/min,吸氣-呼氣1∶2，潮氣量350～550 mL,并根據血氣分析調整通氣。

在氣管外側，剝離出頸外靜脈，遠心端結扎，近心端用動脈夾夾緊，在靜脈中央煎一小口，插入帶有三通閥的聚乙烯插管，止血鉗輕輕夾住沒入血管的插管部分，打開動脈夾，慢慢旋轉插管，直至插管進入冠狀靜脈竇，手術線結扎，放止血鉗。取血時候，旋轉三通，血液即由導管口流出，以便于各個時時的采血，每次采血前應放出少量血以防止枸櫞酸鈉影響指標測定。

最后沿胸骨左緣切開皮膚及肌肉，切斷左第四肋骨胸骨端，暴露心臟，于離膈神經前約1 cm處剪開心包膜，并將心包膜邊緣縫于胸壁上，使心臟左側壁充分暴露，找出心臟表面最粗大的橫行走向的血管(為冠狀動脈左前降支)。分離冠狀動脈左前降支中斷(離前降支起點下1/3處選一結扎點)，穿線以備結扎，造成急性實驗性心肌缺血模型。

針灸針分別插入犬左上、右上、左下肢皮膚表層，放置心電圖肢本導聯電極，通過BL-420F生物機能實驗系統觀測標準n導聯心電圖。

縫置多點固定式心外膜電極，連結十六道生理記錄儀，描記心外膜電圖(ST段升高的電極數表示心肌梗死范圍的大小，以ST段升高量作為心肌損傷程度)。

手術穩定20 min后，結扎冠脈，結扎線以下，心肌立即出現黑紫色變化，同時心電圖上出現缺血改變。

結扎30 min后，并立即經十二指腸給予實驗藥物或生理鹽水[1-4]。

2.3 造模成功的判斷方法

造模成功的判斷標準，以心電圖上出現的缺血改變為主，各實驗組動物，結扎時，心外膜心電圖上ST抬高大于2 mv，肢體導聯電極心電圖上J點抬高，或出現病理性Q波，即為造模成功。

2.4 血液樣本的采集方法

各實驗組動物，分別與結扎前30 min(正常值)、結扎后30 min(缺血前即藥前)、十二指腸給藥30 min、60 min、120 min、180 min進行抽血，抽血時，每個時間點均用5 mL肝素鈉抗凝管2個，2 mL 32%檸檬酸鈉抗凝管2個、2 mL EDTA-K抗凝管1個抽血，并立即進行血氣分析。抽血時，輕輕顛倒搖晃血液。

2.5 血漿心肌酶的測定方法

分別按肌酸激酶同工酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、谷草轉氨酶(AST)、羥丁酸脫氫酶(HBDH)等測定試劑盒的說明書配制好反應液，并放置在AthlonX GLAMOUR2000全自動生化分析儀機器盤中；取2.5項下各時間段的枸櫞酸鈉抗凝管血液樣本，放置在離心機中，以2 500 r/min的速度，離心5 min，取血清，放入1.5 mLEP管中，放在AthlonX GLAMOUR2000全自動生化分析儀機器盤中，利用Autoanalyzer操作軟件，設置好參數，進行測定，并記錄。

2.6 統計學處理

3 實驗結果

3.1 肌酸激酶同工酶(CK)測定

由表1可知，模型組隨著冠脈結扎時間的延長逐漸升高；延胡索總生物堿滴丸劑高、中、低劑量組和丹參滴丸陽性組，都能明顯抑制心肌缺血引起的CK升高，與模型組比較，其相對變化率明顯低于模型對照組(P<0.05)。

3.2 乳酸脫氫酶(LDH)活性的測定

由表2可知，隨著冠脈結扎時間的延長，乳酸脫氫酶LDH含量持續升高，延胡索總生物堿滴丸劑高、中、低劑量組和丹參滴丸陽性組，均能明顯抑制LDH的升高,與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)。

3.3 對犬肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性的測定

表1 延胡索生物堿滴丸對犬血清CK活性的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01;與本組給藥前比較，#P<0.05，##P<0.01

表2 延胡索生物堿滴丸對犬血清LDH活性的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01;與本組給藥前比較，#P<0.05，##P<0.01

表3 延胡索生物堿滴丸劑對犬血清CK-MB活性的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01;與本組給藥前比較，#P<0.05，##P<0.01

由表3可知，模型組隨著冠脈結扎時間的延長，CK-MB持續升高，而延胡索總生物堿滴丸劑高、中、低劑量組和丹參滴丸陽性組能抑制血清CK-MB升高，與模型組比較，有顯著差異(P<0.05)；與自身藥前值比較，延胡索總生堿滴丸劑高、中、低劑量組和丹參滴丸陽性組在給藥后，血清CK-MB含量變化不明顯(P>0.05)。

3.4 對犬血清谷草轉氨酶(AST)的測定

由表4可知，冠脈結扎后，模型組血清AST持續升高，延胡索總生物堿滴丸劑高、中、低劑量組能抑制血清AST的升高，與模型組比較，延胡索總生物堿滴丸劑中劑量組在60 min后，抑制作用明顯，且有顯著性差異(P<0.05)；延胡索總生物堿滴丸劑高、低劑量組和丹參滴丸陽性組，能抑制血清AST升高，但和模型組比較，無顯著性差異(P>0.05)。

表4 延胡索總生物堿滴丸劑對犬血清AST的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01;與本組給藥前比較，#P<0.05，##P<0.01

3.5 對血清羥丁酸脫氫酶(HBDH)的測定

由表5可知，冠脈結扎后，模型組血清HBDH持續升高，延胡索總生物堿滴丸劑高、低劑量組和丹參滴丸陽性組，能明顯抑制血清HBDH的增高，但和模型組比較，無顯著性差異(P>0.05)；延胡索總生物堿滴丸劑中劑量組，能明顯抑制血清HBDH的增高，且和模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)。

表5 延胡索總生物堿滴丸劑對犬血清羥丁酸脫氫酶(HBDH)的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01;與本組給藥前比較，#P<0.05，##P<0.01

4 討論

犬開胸結扎冠狀動脈法建立心肌缺血模型，創傷大、手術復雜,但仍是最接近人臨床冠心病人的模型方法。肌酸磷酸激酶(CK)廣泛存在于胞漿中，尤其以心肌細胞中較多，當心肌細胞損傷時CK溢出，血清CK活性越高，反映心肌損傷越嚴重，臨床上，該酶主要用于診斷心肌梗塞，且該酶對心肌梗塞診斷的特異性高于乳酸脫氫酶(LDH)和谷草轉氨酶(AST)，為早期診斷急性心肌梗塞的一項敏感指標[5]。按照國家中藥新藥治療冠心病藥效學的技術要求，本實驗觀察了延胡索總生物堿滴丸對犬急性心肌缺血模型的心肌酶譜影響。從實驗結果可知：模型組隨著冠脈結扎時間的延長逐漸升高；延胡索總生物堿滴丸高、中、低劑量組和丹參滴丸組，都能明顯抑制心肌缺血引起的CK升高，與模型組相比，其相對變化率明顯低于模型對照組(P<0.05)。與各給藥前自身比較，模型組給予生理鹽水后30～180 min，CK變化率明顯高于藥前值；延胡索生物堿滴丸高、低劑量組、丹參滴丸陽性對照組，藥后30～60 min，CK變化率明顯低于藥前值；中劑量組藥后30～180 min，均低于藥前值。延胡索總生物堿滴丸起效較快，作用時間長，有些指標優于丹參滴丸。實驗結果證明延胡索總生物堿滴丸可有效降低心肌酶的濃度，對犬急性心肌缺血模型有保護作用。