附子理中湯治療胃潰瘍的藥效機(jī)制探討

黃家望，謝希，陳平安，袁娉，廖燦，劉俊杰，李玲*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208; 4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

胃潰瘍主要是指胃黏膜被胃消化液自身消化造成的超過(guò)黏膜肌層的組織損傷，是發(fā)生于賁門與幽門之間的炎性壞死病變，是消化性潰瘍中最常見(jiàn)的一種，其表現(xiàn)為中央部位炎性壞死和典型水腫[1]。其主要機(jī)制與水液代謝的動(dòng)態(tài)平衡密切相關(guān)。無(wú)水乙醇等化學(xué)因素所致的急性胃損傷模型伴有細(xì)胞內(nèi)外特征性水腫反應(yīng)[2-3]。AQP1、AQP3、AQP4可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞連接的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)對(duì)傷口進(jìn)行修復(fù)[4]，是人體胃組織中主要表達(dá)的水通道蛋白[5]。附子理中湯由附子、人參、干姜、甘草、白術(shù)組成。附子理中湯在臨床主要用于“脾陽(yáng)虛”等相關(guān)疾病的治療，但未見(jiàn)其對(duì)胃潰瘍藥效機(jī)制研究。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，模型組潰瘍周圍見(jiàn)水腫，正常對(duì)照組大鼠未出現(xiàn)水腫，而附子理中湯水煎液灌胃后能顯著改善大鼠胃潰瘍水腫。基于此，推測(cè)附子理中湯抗胃潰瘍的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)水液代謝平衡相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究附子理中湯對(duì)大鼠水通道蛋白基因表達(dá)的影響，從水液代謝途徑探討附子理中湯抗食醋誘導(dǎo)的胃潰瘍的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo)，凈化工作臺(tái)(吳江凈化，YJ-875A)，超微量分光光度計(jì)(德國(guó)IMPLEN)，實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Bio-RadFX Connect)，微量移液器(德國(guó)eppendorf)、石蠟切片機(jī)(美國(guó)A0820)。

1.2 主要試劑

1.2.1 糯米白醋

萊陽(yáng)魯花醋業(yè)食品有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)日期為2018年5月28日，保質(zhì)期24個(gè)月，食品生產(chǎn)許可證編號(hào)為SC10337068208749。

RT-PCR檢測(cè)相關(guān)試劑Trizol(Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(promega，A3500)，qPCR mix(promega,A6001)，AQP1、AQP3、AQP4引物(生工)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

200 g左右SD雄性大鼠20只，由斯萊克景達(dá)動(dòng)物公司提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SYXK(湘)2013-0005。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥品

藥物均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，按動(dòng)物體表面積劑量換算法，用雙蒸餾水制備大鼠臨床等效劑量的各藥物水溶液。見(jiàn)表1。

表1 藥物說(shuō)明及小鼠臨床等效用量

2 研究方法

2.1 食醋干預(yù)大鼠胃潰瘍模型建立與實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)

將大鼠隨機(jī)分為空白組和食醋灌胃組，禁食4 h、禁水1 h后，以食醋灌胃建模，1.5 mL/(100 g·d)，連續(xù)灌胃5 d，灌胃后1 h恢復(fù)飲食飲水，食醋造模最后一天灌胃完后將食醋灌胃組隨機(jī)分為空白組、模型組、雷尼替丁組、附子理中湯組。

表2 實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù)方式

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 一般情況

末次給藥后，大鼠禁水禁食8 h，處理動(dòng)物。常規(guī)記錄大鼠一般情況和體質(zhì)量，分離脾臟、胃臟并稱重。

2.2.2 HE染色法觀察大鼠胃腸組織病理變化

選取大鼠病變區(qū)胃組織和十二指腸，10%中性甲醛固定、梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，間斷連續(xù)5 μm厚切片，HE染色、脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

2.2.3 RT-PCR法檢測(cè)胃組織AQP1、AQP3、AQP4基因的表達(dá)

取胃組織，Trizol法提取各組肺組織總RNA，超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度后將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此cDNA為模板用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)操作均按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。qPCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，循環(huán)40次。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組AQP1、AQP3、AQP4相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表3。

表3 引物序列

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 附子理中湯對(duì)胃潰瘍大鼠一般情況的影響

如圖1所示：空白組大鼠精神良好，毛發(fā)有光澤，活動(dòng)、進(jìn)食、排便正常，體質(zhì)量飲食自然增加；模型組出現(xiàn)豎毛、毛色缺乏光澤、弓背、蜷臥、活動(dòng)減少、便溏，肛周污穢，體質(zhì)量飲食下降，胃指數(shù)、脾指數(shù)下降，與空白組相比，差異顯著(P<0.05)；各藥物干預(yù)組均能不同程度的改善的一般情況，與模型組相比較，差異顯著(P<0.01、0.05)，干預(yù)效果為雷尼替丁稍優(yōu)于附子理中湯，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2 附子理中湯對(duì)胃潰瘍大鼠胃腸組織病理變化的影響

如圖2所示：正常大鼠胃組織大體觀見(jiàn)胃黏膜及黏膜皺襞正常，未見(jiàn)糜爛、出血、潰瘍?cè)睿荒Ｐ徒M大鼠胃組織大體觀可見(jiàn)胃竇前壁食醋注射區(qū)形成圓形或橢圓形的深大潰瘍，邊緣整齊，狀如刀切，底部平坦，周圍糜爛充血水腫；各藥物組大體觀可見(jiàn)胃黏膜光整完好與正常無(wú)異，黏膜皺襞明顯，未見(jiàn)糜爛、出血水腫，可見(jiàn)潰瘍?cè)钚迯?fù)。

如圖3、4所示：正常大鼠顯微鏡下可見(jiàn)胃竇壁結(jié)構(gòu)完整，明顯可見(jiàn)黏膜、黏膜下層分層，黏膜腺體排列整齊，無(wú)黏膜上皮破壞、脫落、出血、無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，胞漿勻稱，無(wú)空泡及核固縮；模型組顯微鏡下可見(jiàn)胃竇壁結(jié)構(gòu)明顯破壞，黏膜腺體消失，黏膜面表層見(jiàn)滲出物及壞死組織，其下為肉芽組織，并見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，潰瘍周圍腺體胞漿有空泡，核固縮或細(xì)胞破裂，而間質(zhì)見(jiàn)充血水腫及新生毛細(xì)血管出現(xiàn)；各藥物組顯微鏡下可見(jiàn)胃竇壁局部腺體排列紊亂，滲出物及壞死組織逐漸吸收、排出，已被破壞的肌層由底部肉芽組織增生形成瘢痕充填修復(fù)，未見(jiàn)明顯出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

如圖5、6所示：正常大鼠十二指腸可見(jiàn)腸黏膜和黏膜下層結(jié)構(gòu)完整且連續(xù)，腸絨毛排列整齊，肌層正常，無(wú)黏膜上皮破壞、脫落、出血，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠腸黏膜和黏膜下層破壞且不連續(xù)，肌層受損，黏膜面表層見(jiàn)滲出物及壞死組織，其下為肉芽組織，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥嚴(yán)重；各藥物組腸黏膜和黏膜下層開(kāi)始修復(fù)且部分見(jiàn)連續(xù)，肌層由底部肉芽組織增生形成斑痕組織充填修復(fù)，炎癥滲出物逐漸吸收、排出，見(jiàn)腸絨毛增生。

3.3 附子理中湯對(duì)胃潰瘍大鼠AQP1、AQP3和AQP4基因表達(dá)的影響

如圖7所示：食醋灌胃干預(yù)后，胃組織中AQP1表達(dá)水平下降,AQP3、AQP4表達(dá)水平增加，與正常對(duì)照組比較，差異顯著(P<0.05)。藥物干預(yù)后各組大鼠胃組織中AQP1水平不同程度增加，AQP3、AQP4水平不同程度降低，與模型組比較，差異顯著(P<0.05)。干預(yù)效果為雷尼替丁優(yōu)于附子理中湯。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量、飲食、胃指數(shù)、脾指數(shù)的比較

圖2 各組大鼠胃組織大體標(biāo)本的比較

圖3 各組大鼠胃組織病理變化的比較(HE，×40)

圖4 各組大鼠胃組織病理變化的比較(HE，×100)

圖5 各組大鼠十二指腸病理變化的比較(HE，×40)

圖6 各組大鼠十二指腸病理變化的比較(HE，×100)

圖7 各組大鼠胃組織中AQP1、AQP3和AQP4mRNA表達(dá)的比較

4 討論

食醋灌胃干預(yù)后使得大鼠胃黏膜受損，使胃上皮細(xì)胞間的緊密連接處脂肪蛋白質(zhì)、微循環(huán)等被破壞，胃的負(fù)擔(dān)加重或刺激過(guò)強(qiáng)，從而形成潰瘍[6]。潰瘍的發(fā)生與水液代謝的動(dòng)態(tài)平衡密切相關(guān)。水通道蛋白(AQPs)是近年發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)水液跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的一類膜蛋白[7-8]，在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)廣泛分布，人體的胃組織中AQP1、AQP、3AQP4表達(dá)強(qiáng)烈[5]。有研究表明[9-11]，AQP1和AQP4在維持胃黏膜完整性方面起著重要作用，增強(qiáng)了胃對(duì)乙醇所致水腫的防御,AQP3在胃腺癌細(xì)胞中起著重要作用，參與幽門螺旋桿菌感染引發(fā)胃癌的過(guò)程。胃炎、胃潰瘍等胃腸道疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸均與AQPs對(duì)水液代謝調(diào)節(jié)密切相關(guān)[12-13]。AQP1和AQP4還參與了乙醇和辣椒素致急性胃黏膜水腫和損傷的進(jìn)程[2]。因此，水通道蛋白是藥物治療水液代謝平衡失調(diào)的重要作用靶點(diǎn)[14]。本研究結(jié)果證實(shí)AQP1、AQP3和AQP4在胃潰瘍的發(fā)病機(jī)制中有著重要作用，通過(guò)介導(dǎo)水液跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)水液代謝的動(dòng)態(tài)平衡，改善胃黏膜的潰瘍程度，起到治療作用，與潰瘍程度成負(fù)相關(guān)。

附子理中湯為《傷寒論》理中湯加大辛大熱之附子而成，是傳統(tǒng)的溫中名方。《傷寒論》中記載理中湯由附子、人參、干姜、白術(shù)和炙甘草組成；具有補(bǔ)虛回陽(yáng)，溫中祛寒，補(bǔ)氣健脾的作用。方中附子和干姜具有抗?jié)兒玩?zhèn)痛抗炎的作用，對(duì)溫里藥治療臍腹冷痛起到了加強(qiáng)作用；甘草、白術(shù)也都具有抗消化道潰瘍、抗炎鎮(zhèn)痛的藥理作用；且甘草解百毒，與附子、干姜同煮，可使附子毒性大減。諸藥合用，標(biāo)本兼顧，脾腎雙補(bǔ)，溫中散寒，中陽(yáng)建運(yùn)，復(fù)使清陽(yáng)上升，濁陰下降，清濁各行其道，故臨床療效顯著。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究證明[15]，附子理中湯能增強(qiáng)小鼠的耐寒能力，對(duì)醋酸引起的小鼠腹痛有顯著的鎮(zhèn)痛作用，同時(shí)還可顯著提高胃黏膜的SOD活性，降低MDA的含量，發(fā)揮其對(duì)胃黏膜保護(hù)作用，從而加速潰瘍愈合。

綜上所述，附子理中湯能顯著提高AQP1的表達(dá),下調(diào)AQP3和AQP4的表達(dá)，表明附子理中湯抗食醋誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍的藥效機(jī)制可能是通過(guò)提高AQP1和下調(diào)AQP3、AQP4的表達(dá)，調(diào)節(jié)水液代謝動(dòng)態(tài)平衡，介導(dǎo)水液跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而起到保護(hù)胃黏膜的作用，最終改善大鼠胃組織潰瘍和水腫程度。但水液代謝平衡與AQP1、AQP3和AQP4是否為食醋誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍的唯一機(jī)制還需進(jìn)一步的機(jī)制研究，而附子理中湯的藥效成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)多樣，其抗食醋誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍的物質(zhì)基礎(chǔ)需要進(jìn)一步研究。