自擬潰結灌腸方調控Akt/NFκB信號通路治療大鼠潰瘍性結腸炎的作用機制研究

顧紅，馬炯，袁保，王雯雯

(南京中醫藥大學江陰附屬醫院肛腸科，江蘇 江陰 214400)

潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis, UC)是特發于結腸或者直腸黏膜的一種慢性腸道炎癥疾病，屬于炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease, IBD)其中一種。本病可始于直腸，通常以連續的方式向近端延伸至部分或整個結腸[1]。潰瘍性結腸炎的全球發病率約為1～24人/萬人[2]，腹瀉和黏液膿血樣大便是UC的特征性癥狀，此外本病尚可出現腹痛、發熱或腸外臨床癥狀[1]。理論研究表明UC發病與遺傳、環境和飲食習慣等多種因素關系密切，發病機理復雜，尚無較好的針對性治療方法[3]。西醫多采用抗炎、免疫抑制劑、激素治療UC，近年來肽類/蛋白類制劑用于UC的治療亦取得了一定成效[4]，但是長期應用可能引起耐藥、機體免疫功能障礙、肝腎損傷等，副作用較大，加上價格昂貴，限制了藥品的使用，因此臨床上亟待開發出低毒高效的潰瘍性結腸炎的治療藥物。祖國傳統醫藥燦若瑰寶，在UC治療方面，中醫藥治療具有治療途徑多(包括口服、外用、輔助手段等)，療效確切，副作用小的特點[5-7]。筆者依據UC發病機制，結合長期臨床經驗，采用自擬的潰結灌腸方治療UC取得了較好的療效，但其作用機制尚不明確。因此，本研究采用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導大鼠UC模型，通過檢測藥物對白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)含量變化，并結合現代分子生物學手段研究藥物對蛋白激酶B(Akt)及核轉錄因子(NFκB)蛋白表達的影響，探討自擬潰結灌腸液對UC大鼠腸道炎癥的作用機制。現報告如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

35只健康SD雄性大鼠，8周齡，體質量(200±20)g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物合格證編號：SCXK(滬)2018-0006。

1.2 藥物與實驗試劑

自擬潰結灌腸方組成：荔枝草30 g，茜草炭10 g，紫草15 g，五倍子5 g。藥物加入500 mL蒸餾水浸泡30 min后，100℃沸水提取30 min，提取3次，合并濾液，50℃減壓蒸餾獲得濃縮浸膏，生理鹽水復溶，配置成0.5 g/mL的溶液，4℃保存備用。柳氮磺吡啶腸溶片(批號：22181013，上海信福達制藥有限公司)，用研缽將藥品均勻研成粉末，生理鹽水溶解，配置成0.35 g/mL的溶液，4℃保存備用。

葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulfate Sodium, DSS, MW5kDa, 貨號S14048)購自上海源葉生物科技有限公司；IL-1、IL-6及TNF-αELISA試劑盒(貨號：PI303，PI328，PT516)購自上海碧云天生物制劑公司；Akt(貨號：#4691， 稀釋比例1∶1 000)，p-Akt(貨號：#9271, 稀釋比例1∶1 000)，NFκB(貨號：#6956, 稀釋比例1∶1 000)，p-NFκB(貨號：#3033, 稀釋比例1∶1 000)，辣根過氧化酶標記的兔二抗(貨號：#7074, 稀釋比例1∶2 000)，辣根過氧化酶標記的鼠二抗(貨號：#7076, 稀釋比例1∶2 000)購自美國Cell Signaling Technology公司。全蛋白提取試劑盒(貨號：KGP2100)、BCA蛋白含量檢測試劑盒(貨號：KGP902)，5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(貨號：KGP101X)購自凱基生物技術股份有限公司。尿糞隱血檢測試劑盒(貨號：C027-1-1)購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗儀器與設備

顯微鏡為蔡司Axio Zoom.V16 Zoom Microscope(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)；酶標儀為Molecular Devices Spectra Max Plus automatic plate reader (Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)；凝膠成像系統為天能2500R；垂直電泳系統、轉膜系統購自北京君意東方電泳設備有限公司；高速冷凍離心機為長沙湘智高速離心機，型號TGL21M；勻漿器為滬析FJ200。

2 實驗方法

2.1 分組與造模

35只SD大鼠飼養于南京中醫藥大學動物實驗中心(SPF級，12/12 h明暗交替，溫度20±2℃，濕度40%～60%)，適應性喂養1周后進行隨機分組，空白對照組6只(CON組)，其余29只大鼠參考前人文獻采用DSS誘導建立UC模型[8]，具體方法為：配制5%的DSS溶液，給予大鼠自由飲用7 d，對照組給予飲用蒸餾水。造模結束后隨機選取5只取結腸組織，進行病理切片，判斷模型是否復制成功。其余24只UC大鼠隨機分為4組，每組6只，即模型組(UC組)，柳氮磺吡啶陽性藥組(SUL組)，自擬潰結灌腸方低劑量組(KJF-L組)及自擬潰結灌腸方高劑量組(KJF-H組)。

2.2 給藥劑量及給藥方法

造模結束后，分別進行灌腸給藥，陽性藥組給予0.35 g/kg的柳氮磺吡啶灌腸液，中藥給藥低劑量組給予3 g/kg的潰結灌腸方提取液，高劑量組給予6 g/kg的潰結灌腸方提取液；空白對照組和UC模型組給予同體積生理鹽水進行灌腸。灌腸體積均為1 mL/100 g，每日給藥1次，給藥周期為14 d。具體灌腸方法為：大鼠麻醉后，采用注射器吸取藥液或對照溶液，經兒童用肛軟管插入大鼠肛門8 cm處進行灌腸，操作時應注意避免損傷大鼠腸道，灌腸結束后保持大鼠仰臥位，避免藥液流出，直至大鼠蘇醒后放歸飼養籠。

2.3 樣品采集

(1)血液樣品：末次灌腸治療結束后，禁食不禁水12 h后，大鼠麻醉后，迅速用注射器抽取心臟血置于離心管中，4000轉離心15 min后取上清，分裝后于-80℃凍存待測。

(2)組織樣品：沿腹中線剖開腹部，取肛門處向上6～10 cm左右的結腸，采用冰冷生理鹽水沖洗結腸腸管，剪刀剖開腸管，觀測病變情況，選取病變明顯的部位，用4%多聚甲醛溶液固定，剩余病變組織采用液氮速凍保存備用。

2.4 指標觀察和檢測

(1)疾病活動指數評價：實驗周期中，注意觀察大鼠毛發、精神狀態、活動程度。并于造模結束后，記錄大鼠體質量，觀察大鼠糞便性狀，檢測糞便潛血，根據評估疾病活動指數(DAI)=體質量下降指數+大便性狀+大便潛血)/3計算公式，評價UC疾病活動指數。具體評價標準如下：體質量下降指數：無下降記0分，下降1%～5%記1分，5%～10%記2分，10%～20%記3分，大于20%記4分；大便性狀：正常記0分，松軟記2分，腹瀉記4分；大便潛血，無記0分，陽性2分，肉眼可見便血記4分[8-9]。

(2)結腸組織病理學評價：4%甲醛固定的結腸病變組織經過脫鈣、脫水、透明、浸蠟包埋后，采用自動切片機制作成厚度5 μm的切片，常規HE染色后，采用光學顯微鏡觀察結腸黏膜形態結構，并進行病理學評分，評分標準參考Dieleman等人[10]的研究。評分分為4部分：①病變深度：0分，無病變；1分，病變侵襲黏膜表層；2分，病變侵襲至黏膜下層；3分，病變穿透黏膜。②炎癥程度：0分，無炎癥；1分，炎癥程度輕；2分，炎癥程度中；3分，炎癥程度重。③病變范圍：0分，無病變；1分，小于25%；2分，大于25%，小于50%；3分，大于50%，小于75%；4分，大于75%。④隱窩損傷：0分，無；1分，1/3隱窩損傷；2分，2/3隱窩損傷；3分，隱窩損傷，上皮表面完整；4分，隱窩損傷，上皮表面消失。

(3)血清中IL-1、IL-6、TNF-α檢測：嚴格按照ELISA檢測試劑盒進行操作。

(4)Westernblot檢測結腸組織中Akt、NFκB蛋白的表達：取液氮凍存的各組結腸組織，電動勻漿器研磨組織獲得勻漿，采用全蛋白提取試劑盒提取組織蛋白，并用BCA試劑盒測定蛋白含量，調整濃度為5 mg/mL。加入SDS上樣緩沖液使蛋白變性。25 μg變性蛋白采用垂直電泳系統在10% SDS聚丙烯酰胺凝膠上進行分離，并轉移到PVDF膜上。膜用5%脫脂奶粉溶液常溫封閉2 h。按比例稀釋Akt、NFκB及對應磷酸化抗體，將膜與一抗4℃孵育過夜。清洗殘余一抗，將膜與辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育2 h。采用化學發光法檢測蛋白，采用天能成像系統采集光學信號。采用成像儀自帶的圖像分析系統對Western條帶進行灰度分析，并計算平均值(n=3)。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況觀察及DAI評分比較

正常組大鼠毛皮光滑，行動敏捷，大便性狀正常，飲食飲水量無明顯變化，體質量逐漸增加。而UC模型組隨著造模時間增加逐漸出現停滯不動，行動遲緩，糞便不成形，造模后期出現明顯肉眼可見的便血，進食飲水量減少。而給予自擬潰結灌腸方治療可逆轉上述癥狀。DAI評分見表1，結果表明與空白組相比，模型組DAI評分顯著升高(P<0.01)，給予自擬潰結灌腸方后DAI評分隨劑量升高降低(P<0.01)。

表1 自擬潰結灌腸方對DSS誘導UC大鼠模型中對DAI評分的作用

注：與對照組比較，##P<0.01;與模型組比較，**P<0.01

3.2 結腸黏膜組織病理切片評價

由圖1可以看出，空白對照組小鼠結腸黏膜平整、皺襞清晰，腺體結構完整，無炎性介質。與空白組相比，模型組小鼠結腸病理切片顯示黏膜結構變形扭曲，黏膜上皮層有缺失，固有層腺體數量顯著減少，并伴隨慢性炎性細胞增多，病理學評分(見表2)顯著高于空白組(P<0.01)。給予中藥治療后，與模型組相比，中藥組和柳氮磺吡啶組小鼠結腸潰瘍部位病理切片顯示，腺體結構完整度均逐漸好轉，潰瘍面逐漸減少，慢性炎細胞浸潤也顯著低于模型組，病理評分顯著降低，具有顯著性差異(P<0.01)。

注:CON：對照組;DSS：葡聚糖硫酸鈉誘導的UC模型組;DSS+KJF-L：模型+潰結灌腸方低劑量組;DSS+KJF-H：模型+潰結灌腸方高劑量組;DSS+SUL：模型+陽性藥柳氮磺吡啶組圖1 自擬潰結灌腸方對DSS誘導UC大鼠模型中結腸病理切片的影響(×100)

表2 自擬潰結灌腸方對DSS誘導UC大鼠模型腸粘膜病理評分比較

注：與對照組比較，##P<0.01;與模型組比較，**P<0.01

3.3 大鼠血清中IL-1、IL-6及TNF-α含量比較

由表3可以看出，與正常組相比，DSS誘導的UC大鼠模型血清中IL-1、IL-6及TNF-α含量顯著升高(P<0.01)；給予藥物治療后，與模型組相比，自擬潰結灌腸方各劑量組及陽性藥柳氮磺吡啶組均可顯著降低上述指標(P<0.01)

表3 自擬潰結灌腸方對DSS誘導UC大鼠模型中促炎細胞因子的影響

注：與對照組比較，##P<0.01;與模型組比較，**P<0.01

3.4 大鼠結腸組織中Akt、NFκB蛋白表達影響

本研究進一步采用westernblot研究自擬潰結灌腸方治療DSS誘導的潰瘍性結腸炎的作用機制。與空白組相比，模型組腸道中Akt磷酸化水平顯著升高(P<0.01, 圖2A)，給予藥物治療后，Akt磷酸化水平顯著降低(P<0.01, 圖2A)；模型組中NFκB磷酸化水平顯著升高(P<0.01, 圖2B)，給予自擬潰結灌腸方治療后，NFκB磷酸化水平顯著降低(P<0.01,圖2B)。

注:CON：對照組;DSS：葡聚糖硫酸鈉誘導的UC模型組;DSS+KJF-L：模型+潰結灌腸方低劑量組;DSS+KJF-H：模型+潰結灌腸方高劑量組;DSS+SUL：模型+陽性藥柳氮磺吡啶組;與對照組比較，##P<0.01;與模型組比較，**P<0.01圖2 自擬潰結灌腸方對DSS誘導UC大鼠模型中結腸組織AKT(A)及NFκB(B)的影響

4 討論

潰瘍性結腸炎是遺傳、環境、生活習慣、機體免疫等多種因素誘發的腸道組織慢性炎癥反應[3]。炎癥反應是本病最主要的病理變化，主要包括致炎因子水平失衡、黏膜水腫、炎性細胞滲出等。研究表明UC患者及相關動物模型中白介素、腫瘤壞死因子等促炎細胞因子指標顯著升高[8,11-13]。因此,抗炎治療是治療UC的一種重要措施。西醫抗炎治療UC多采用水楊酸及激素類藥物，但存在藥物不耐受、副作用明顯、易復發等問題。因此臨床亟需尋找新的治療UC的方法。中藥灌腸治療UC因其性質溫和刺激性小、直達患處、避免口服藥首過效應、且由于藥物直接進入腸道，有利于藥物有效成分直接吸收入血循環，因而效果顯著，且中藥灌腸具有副作用小、費用相對于免疫抑制劑費用低廉，復發率低的優勢，不僅成為臨床常用的治療方法，也引起了研究者的注意[6,14-15]。

根據UC的發病機制及特點，結合中醫古籍腸道癥狀的描述，可將UC劃歸于“久痢”“腸澼”等范疇。結合臨床實踐，自擬潰結灌腸方進行局部灌腸治療UC，獲得良好效果，本方主要由荔枝草、茜草炭、紫草、五倍子組成。荔枝草性苦涼，具有清熱解毒，涼血止血作用；茜草止血而不留瘀；紫草有涼血、活血功效；五倍子，味酸澀，歸肺、大腸、腎經，具有澀腸止瀉，收濕斂瘡之功效。諸藥合用涼血止血，澀腸止瀉，清熱化濕，去腐斂瘡。本方配伍合理、效果顯著，受到患者好評。為進一步探索自擬潰結灌腸方治療UC的作用機制，本研究采用國際公認的造模方法，采用5%DSS誘導構建大鼠UC模型，給予本方治療后，對大鼠DAI疾病活動評分，血清炎性細胞因子指標IL-1、IL-6及TNF-α含量，結腸組織Akt及NFκB磷酸化水平進行評價。本研究發現，DSS造模后第二日大鼠即出現便潛血陽性、糞便稀不成形的特點，隨著造模時間增加，大鼠出現活動減少、反應遲鈍、毛發發暗粘連等癥狀，DAI指數顯著升高。病理切片顯示DSS誘導的模型大鼠結腸黏膜結構破壞，炎性細胞浸潤，與人類UC情況相似。給予自擬潰結灌腸方灌腸后，大鼠DAI指數顯著降低，病理切片顯示炎性細胞浸潤減少，結腸黏膜結構得到一定程度的恢復。細胞因子IL-1、IL-6及TNF-α與炎癥關系密切，在炎性反應的發生、放大中起重要作用，是UC發病中重要的炎癥指標[16]。實驗發現，DSS誘導的UC大鼠模型血清中IL-1、IL-6及TNF-α顯著上升，經過自擬潰結灌腸方灌腸治療的大鼠上述指標顯著下降，提示本方可通過抑制炎性細胞因子，減輕炎癥反應從而達到治療UC的目的。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，Akt參與的信號轉導通路在炎性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的發病機制中起到重要作用，許多研究表明抑制Akt蛋白磷酸化可以減少炎性細胞因子釋放，起到治療潰瘍性結腸炎的作用[17-18]。除此之外，NFκB同樣參與炎癥細胞因子信號轉導，具體表現為：NFκB由同型或異二聚體p50/p65和抑制性IκB蛋白組成，IκB激酶復合物(IKKβ)被激活后，IκB磷酸化并最終降解。IκB的降解進一步導致p50/p65的激活，激活的p50/p65進入細胞核并激活其下游靶基因的轉錄，包括TNF-α，IL-1，IL-6，IL-17和其他炎癥介質，從而促進腸道炎癥的發生發展[15]。綜上所述，在腸道炎癥過程中，Akt/NFκB信號通路通過調節轉錄和翻譯，密切參與調節炎癥介質的合成，抑制Akt/NFκB信號通路可以減少炎癥細胞因子的釋放，減輕炎癥反應，治療UC[17-18]。本實驗研究結果與前人研究一致，結果表明，DSS誘導的UC模型中Akt及NFκB磷酸化水平顯著升高，給予自擬潰結灌腸方治療可抑制Akt及NFκB磷酸化，減輕炎癥反應，治療UC。

本研究結果提示，以中醫理論為基礎，結合臨床實際情況自擬的潰結灌腸方為治療潰瘍性結腸炎提供了一種新的、效果顯著的臨床治療方法，并初步探討了本方可能通過調節Akt/NFκB信號通路，抑制炎性細胞因子IL-1、IL-6、TNF-α的釋放，減輕炎癥反應，從而達到治療潰瘍性結腸炎的作用，治療效果呈現一定的劑量依賴性。但由于中藥組方成分復雜，我們將進一步尋找其有效活性成分，深入研究其作用機制。