丹皮酚對人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖與凋亡的影響

趙俊云，楊向竹，郭健

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以全身關(guān)節(jié)滑膜異常增生及炎癥為主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫疾病[1]，其中滑膜異常增生主要與滑膜成纖維細胞的類腫瘤細胞的異常增殖及異常分泌表型有關(guān)，在RA發(fā)生發(fā)展中異常活化的滑膜成纖維細胞起著至關(guān)重要的作用，其通過分泌炎癥介質(zhì)進一步導(dǎo)致滑膜炎癥和軟骨損傷，因此成為抗RA藥物的重要靶細胞之一[2]。臨床上RA治療多采用糖皮質(zhì)激素、非甾類抗炎藥、免疫抑制劑或靶向生物制劑等[3]，副作用和不良反應(yīng)多，或價格昂貴，難以長期使用。因此，高效、低副作用一直是抗RA藥物研究的主要問題。植物藥，如雷公藤、白芍、青藤等來源的活性成分已被應(yīng)用于RA治療的研究，顯示一定的療效，但也常伴隨毒副作用的出現(xiàn)[4]。丹皮酚是中藥牡丹(Paeonia suffruticosa)干燥根皮的主要活性成分,課題組前期工作顯示丹皮酚有較好的抗炎和抑制腫瘤細胞增殖的活性[5]。本研究旨在探討丹皮酚在體外對人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖與凋亡的影響，為丹皮酚及其衍生物用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

丹皮酚(Paeonol, PAE)購自國家食品藥品檢定所(no.100447-200701),純度98%； DMEM medium、Fetal Bovine Serum、0.25% Trypsin-EDTA購自Invitrogen; Annexin V-PI Apoptosis Detection Kit購自BD Biosciences；PureLinkTMRNA Mini Kit、TaqManTMGene Expression Master Mix購自Thermo Fisher Scientific；HPRT、Ki-67、Caspase-3 Taqman引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；Anti-human Ki-67 antibody、Anti-human Caspase-3 antibody購自Cell Signal Technology；人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞株MH7A購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞增殖

按常規(guī)方法[5]培養(yǎng)MH7A細胞，使用0.05%胰蛋白酶溶液消化3 min，終止消化后收集細胞，以每孔約4×104個細胞密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，除對照組外，丹皮酚各劑量組分別加入丹皮酚至終濃度為10-6M、5×10-6M、10-5M，每組設(shè)5復(fù)孔，等體積DMSO處理作為對照組，總體積均為200 μL。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT，孵育4～6 h后，每孔吸棄上清液100 μL，每孔加入150 μL DMSO，避光混勻15 min，酶標(biāo)儀檢測OD570，計算抑制率。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

同上制備細胞懸液，以每孔約2×105個細胞密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，除對照組外，丹皮酚各劑量組分別加入丹皮酚至終濃度為10-6M、5×10-6M、10-5M，每組設(shè)3復(fù)孔，等體積DMSO處理作為對照組，培養(yǎng)72 h后收集細胞，PBS洗滌，以每毫升約5×106個細胞密度重懸于結(jié)合緩沖液，每100 μL細胞懸液加入5 μL Annexin V，避光孵育后，加入2 mL結(jié)合緩沖液，離心收集細胞，將細胞重懸于200 μL結(jié)合緩沖液，加入5 μL PI溶液，孵育15 min，上機分析，計算凋亡細胞比例。

1.2.3 qRT-PCR檢測

同上接種細胞和分組給藥處理，培養(yǎng)72 h后收集細胞，按試劑盒說明提取mRNA，檢測濃度和純度，依次進行逆轉(zhuǎn)錄和real-time PCR。

1.2.4 Western blot檢測

同上接種細胞和分組給藥處理，培養(yǎng)72 h后收集細胞，加裂解液處理，離心提取總蛋白，定量后進行SDS-PAGE電泳，使用PVDF膜進行轉(zhuǎn)移電泳，5%封閉液處理1 h后，分別加入稀釋后的Anti-human Ki-67 antibody和Anti-human Caspase-3 antibody，孵育過夜，β-actin作為內(nèi)參抗體，洗膜后，加入稀釋后的二抗，孵育1 h，曝光顯影。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚對MH7A細胞增殖的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，丹皮酚各劑量處理對MH7A細胞的增殖均有明顯抑制作用，見表1。

表1 丹皮酚抑制MH7A的增殖(%)

2.2 丹皮酚對MH7A細胞凋亡的影響

根據(jù)細胞增殖實驗結(jié)果，使用丹皮酚處理細胞72 h后，用流式細胞術(shù)結(jié)合雙染法測定凋亡信號，發(fā)現(xiàn)丹皮酚各劑量組凋亡細胞比例顯著增加(P<0.05或P<0.01)，見表2。

表2 丹皮酚促進MH7A凋亡(%)

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.3 丹皮酚對Ki-67、Caspase-3 mRNA水平的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，各劑量丹皮酚處理細胞72 h后，Ki-67轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.01)，高劑量組Caspase-3轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)，見圖1。

2.4 丹皮酚對Ki-67、Caspase-3蛋白水平的影響

各劑量丹皮酚處理MH7A細胞72 h后，Ki-67蛋白水平顯著降低，Caspase-3蛋白水平顯著升高，見圖2。

注:CTRL：對照組；PAE-L：丹皮酚低劑量組；PAE-M：丹皮酚中劑量組；PAE-H：丹皮酚高劑量組；與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01圖1 Ki-67和Caspase-3 的mRNA水平

注:CTRL：對照組；PAE-L：丹皮酚低劑量組；PAE-M：丹皮酚中劑量組；PAE-H：丹皮酚高劑量組；與對照組比較，**P<0.01圖2 Ki67和Caspase-3 的蛋白水平

3 討論

RA患者關(guān)節(jié)滑膜成纖維細胞的增長和死亡失衡是造成滑膜增生和關(guān)節(jié)炎癥的主要原因[6]，因此,如何有效抑制滑膜成纖維細胞的增殖與促進其凋亡是抗RA藥物研究的重要方向之一。由于RA滑膜成纖維細胞有類似于腫瘤細胞的某些表型，如能在氧化應(yīng)激條件下自主生存[7]，且RA患者關(guān)節(jié)的微環(huán)境也類似于低氧、低營養(yǎng)的腫瘤微環(huán)境，提示對腫瘤細胞增殖和凋亡有影響的藥物可能對滑膜成纖維細胞的增殖和凋亡具有相似作用。

本研究中使用MTT法檢測到丹皮酚對MH7A的體外增殖有抑制作用，且抑制率與劑量及作用時長呈正相關(guān)，丹皮酚中劑量組作用72 h可達到接近50%的抑制率，這顯示丹皮酚具有長時間用藥的可能性，可根據(jù)情況調(diào)整為適當(dāng)劑量。使用流式細胞術(shù)結(jié)合雙染法檢測到丹皮酚各劑量組的凋亡細胞比例較對照組均顯著升高，且凋亡細胞比例隨著藥物濃度的增加而升高，推測丹皮酚可促進MH7A發(fā)生凋亡。

為了進一步明確丹皮酚抑制增殖與誘導(dǎo)凋亡的可能機制，對丹皮酚處理后的細胞進行增殖標(biāo)記物Ki67和重要凋亡基因Caspase-3的表達情況觀察。Ki-67(Cell proliferation-associated nuclear antigen Ki67)是一種細胞增殖必需的核蛋白，被用作細胞增殖標(biāo)記物，常用于腫瘤分級鑒定[8]。本研究使用Ki-67作為主要指標(biāo)來表示MH7A的增殖狀態(tài)。Caspase-3蛋白是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)家族中的一員，其外源性激活將觸發(fā)細胞凋亡途徑，在細胞凋亡中起主導(dǎo)作用[9]。本研究使用Caspase-3作為主要指標(biāo)來表示MH7A的凋亡水平。

本研究中使用qRT-PCR法檢測到丹皮酚處理72 h后，各劑量組Ki-67的mRNA水平均顯著降低，且高劑量組下降幅度最大，與MTT實驗結(jié)果基本一致。而Caspase-3的mRNA水平僅高劑量組有明顯升高，低中劑量組變化并不明顯，推測丹皮酚誘導(dǎo)MH7A凋亡可能存在著閾值效應(yīng)。使用Westernblot法檢測到丹皮酚處理72 h后，各劑量組均出現(xiàn)Ki-67蛋白水平顯著降低，Caspase-3蛋白水平顯著升高，其中Ki-67的組間差異與MTT實驗結(jié)果保持一致，Caspase-3的組間差異并不明顯，進一步提示丹皮酚誘導(dǎo)MH7A凋亡的劑量閾值效應(yīng)。總體上看，丹皮酚在低劑量使用時即可達到抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的效果，這為長期維持用藥提供了可能性。

綜上，丹皮酚是有效的滑膜成纖維細胞體外生長的調(diào)節(jié)劑，結(jié)合其抗炎活性，有望用于RA的臨床治療，后續(xù)研究將以低毒性為目標(biāo)進一步探討其衍生物的開發(fā)及適用劑型的研究。