補(bǔ)脾益腎起痿湯對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)大鼠模型免疫機(jī)制的影響

張運(yùn)克，劉沖沖，王曉含

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種涉及細(xì)胞免疫和體液免疫等多病機(jī)的自身免疫性疾病[1-3]，其主要病理損害在神經(jīng)肌肉接頭處的突觸后膜，且發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[4]，主要由體液免疫介導(dǎo)的乙酰膽堿受體(AChR)抗體及補(bǔ)體系統(tǒng)參與而起病。補(bǔ)脾益腎起痿湯由補(bǔ)中益氣湯合二仙湯加減化裁而成，是全國第三、四批名老中醫(yī)鄭紹周教授治療重癥肌無力的常用方劑，經(jīng)多年的臨床實(shí)踐與觀察，對脾腎虧虛型的肌無力患者治療有效率高達(dá)80%。為探索本方治療MG的作用機(jī)制，我們通過人工合成免疫原法構(gòu)建EAMG大鼠模型，分別應(yīng)用抗原包被法、免疫光比濁法檢測大鼠血清中AChR-Ab的水平變化及血清總IgG、補(bǔ)體C3、TGF-β1的濃度變化，初步探討了補(bǔ)脾益腎起痿湯治療MG的免疫學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司采購健康LEWIS雌性大鼠60只，年齡42～62天，體質(zhì)量150～160 g，合格證號：11400700140544。大鼠飼養(yǎng)在河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心進(jìn)行。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為補(bǔ)脾益腎起痿湯高中低3個劑量組、西藥(強(qiáng)的松)組、模型組及空白對照組共6個組，每組大鼠各10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

人工合成鼠源性AChR-α亞基97～116肽段序列免疫原：購自上海淘普生物科技有限公司，規(guī)格：6 mg/支，分子量：2252.62，純度：98.67%，序列號：DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI(20aa)；完全福氏佐劑(CFA)、不完全福氏佐劑(IFA):購自美國Sigma公司,規(guī)格：10 mL/瓶，CFA貨號：F-5881，IFA貨號：F-5506；磷酸鹽緩沖液(PBS)：購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠/TGF-β1 ELISA試劑盒：購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；大鼠/補(bǔ)體C3、大鼠/總IgG ELISA試劑盒：購于南京建成科技有限公司；iMark酶標(biāo)儀：購自北京友華照欽醫(yī)療器械有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

補(bǔ)脾益腎起痿湯方劑組成：黃芪50 g，生白術(shù)15 g，黨參20 g，升麻15 g，柴胡15 g，陳皮10 g，當(dāng)歸15 g，炙甘草15 g，仙茅15 g，仙靈脾15 g。將上述藥物濃煎至生藥濃度為0.74 g/mL。

醋酸潑尼松片：購自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河醫(yī)院區(qū)，貨號：H33021207。

1.4 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?/h3>

參考許文華[5]免疫乳劑的制備構(gòu)建實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｊ状蚊庖?按照1∶1.5∶1.5的比例將R97～116、CFA、PBS三者充分混勻，于造模組大鼠足墊部、鼠背部多點(diǎn)注射200 μL乳劑(含100 μg R97～116)，于對照組大鼠注射同等劑量的CFA與PBS混合乳劑。第二次及第三次免疫：按照1∶1∶1的比例將R97～116、IFA、PBS三者充分混勻，在首次免疫后的第30天及第45天,取200 μL乳劑(含100 μg R97～116)于造模組大鼠強(qiáng)化接種。

三次免疫結(jié)束后每隔2天對大鼠進(jìn)行肌力測定。依據(jù)Lennon[6]分級法將大鼠肌力分為4級，0級：沒有肯定肌無力的表現(xiàn)，記0分；1級：休息時無明顯異常，但四肢力量較弱，前肢乏力易疲勞，記1分；2級：休息時無精打采，抓握4～5次出現(xiàn)前肢無力，且動作欠協(xié)調(diào)，毛發(fā)不澤，記2分；3級：較重肌無力表現(xiàn)，抓握不能，呼吸喘粗，肌肉震顫，甚至死亡，記3分，嚴(yán)重者記4分。若癥狀介于兩級之間則記為0.5、1.5、2.5分，且數(shù)值可隨肌力表現(xiàn)上下浮動。

1.5 給藥方法

各組大鼠分別連續(xù)灌胃4周。其中補(bǔ)脾益腎起痿湯低、中、高濃度組大鼠分別按16.2 mg/(kg·d)、32.4 mg/(kg· d)、64.8 mg/(kg·d)劑量給予實(shí)驗(yàn)藥物灌胃，西藥組大鼠給予醋酸潑尼松片5.4 mg/(kg·d)，模型組與空白組大鼠給予生理鹽水3 mL/d。

1.6 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測定

1.6.1 新斯的明試驗(yàn)

從免疫后第50天的造模組大鼠中隨機(jī)選取5只，給予新斯的明試驗(yàn)以觀察大鼠肌力的改變情況。新斯的明按照37.5 μg/kg的劑量予腹腔注射,同時予阿托品15 μg/kg腹腔注射拮抗新斯的明毒蕈堿樣反應(yīng)。若12 min后大鼠活動明顯增加，抓握時肌力明顯改善，癥狀改善狀態(tài)持續(xù)2～12 h，則為新斯的明試驗(yàn)陽性。

1.6.2 重復(fù)神經(jīng)電刺激測肌電圖

將經(jīng)過腹腔注射麻醉后的大鼠固定于平板上，切開腓腸肌并暴露坐骨神經(jīng)，并將記錄電極、刺激電極分別置于腓腸肌和坐骨神經(jīng)上,然后用電生理記錄儀記錄復(fù)合動作電位振幅，電極刺激頻率分別為5 Hz和10 Hz，刺激部位為坐骨神經(jīng)，檢測完成后予創(chuàng)口處縫合并予青霉素外敷預(yù)防感染。衰減值用第5個動作電位與第1個動作電位的變化百分比表示。

1.6.3 血清中AChR-Ab、TGF-β1、補(bǔ)體C3及IgG水平測定

取大鼠腹主動脈血約5 mL，離心機(jī)10 000轉(zhuǎn)/min離心15 min，EP管每管120 μL分裝并放置于-20℃冰箱保存。血清使用前10 h放于4℃冰箱緩慢解凍，若有沉淀則快速離心1 min，然后采用抗原包被法測定大鼠血清中AChR-Ab水平，采用免疫光比濁法測定大鼠血清中TGF-β1、補(bǔ)體C3、IgG水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠Lennon評分與血清AChR-Ab濃度

模型組大鼠表現(xiàn)為前肢抓握乏力，嘶咬咀嚼無力，體質(zhì)量增長較緩慢或減輕，毛發(fā)不榮，空白組大鼠則無明顯異常。對各組大鼠進(jìn)行血清AChR-Ab濃度測定，并對模型組大鼠首次免疫50天后進(jìn)行肌力測定，其中評分小于1分、1分至1.5分之間、1.5分至2分之間、2分以上的大鼠分別有4只、3只、20只、23只。

見表1。在肌力評分方面，空白組低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明模型組大鼠肌力明顯減退，EAMG大鼠模型制作成功；在血清AChR-Ab(OD值)方面，空白組低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 大鼠肌力評分與血清AChR-Ab濃度結(jié)果

注：與空白組相對比，▲P<0.05,▲▲P<0.01

2.2 新斯的明試驗(yàn)

大鼠行新斯的明試驗(yàn)12 min后，觀察到其精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，活動明顯增多，肌力明顯提高。見表2。模型組Lennon評分高于空白組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 模型組大鼠在注射新斯的明前后Lennon評分比較分)

注：與注射前評分相比，△P<0.05

2.3 重復(fù)神經(jīng)電刺激檢測肌電圖

從造模組大鼠中隨機(jī)選取5只行肌電圖檢查，衰減值用第5個動作電位對第1個動作電位的變化百分比表示，其大于10%。見圖1及表3。

A EAMG1號

B EAMG2號

C EAMG3號

D EAMG4號

E EAMG5號

F 正常組

表3 肌電圖波值(圖1)

注：圖EAMG1-5組第五波與第一波波值相比電位衰減值>10%，圖1正常組電位基本無變化

2.4 各組大鼠血清中TGF-β1、補(bǔ)體C3、IgG濃度比較

見表4。與空白組相比較，模型組大鼠血清中TGF-β1及補(bǔ)體C3濃度均顯著降低(P<0.01)，應(yīng)用西藥及高中低濃度劑量中藥治療后，TGF-β1及補(bǔ)體C3濃度均有一定程度的升高，與模型組相比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與西藥組相比較，高中低濃度劑量中藥治療后TGF-β1及補(bǔ)體C3濃度均降低，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

與空白組相比較，模型組大鼠血清中IgG濃度明顯升高(P<0.01)，應(yīng)用西藥及高中低濃度劑量中藥治療后，IgG濃度有一定程度的降低，與模型組相比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與西藥組相比較，高中低濃度劑量中藥治療后IgG濃度增高，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 各組大鼠血清中TGF-β1、補(bǔ)體C3、IgG濃度比較

注：與空白組相比較，△P<0.01;與模型組相比較，●P<0.01

3 討論

重癥肌無力是一種由體液免疫介導(dǎo)、細(xì)胞免疫依賴及補(bǔ)體參與的疑難性自身免疫性疾病，主要針對神經(jīng)肌肉接頭 (neuromuscular junction，NMJ)突觸后膜的AChR，其中約74%～88%的全身型MG患者AChR抗體呈陽性[7-8]。IgG抗體能促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用，是體液免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵因子，其亞型包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，以IgG1和IgG3亞型為主的AChR抗體與突觸后膜AChR結(jié)合后可激活補(bǔ)體系統(tǒng)[9-10]，使NMJ處沉積大量補(bǔ)體，并形成膜攻擊復(fù)合物 (membrane attack complex，MAC)，導(dǎo)致補(bǔ)體溶解，AChR被破壞、內(nèi)吞，從而造成NMJ傳遞功能障礙，因此MG發(fā)病與補(bǔ)體系統(tǒng)的激活密切相關(guān)。補(bǔ)體因子可輔助或增強(qiáng)抗體分子，對機(jī)體的防御及免疫系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)至關(guān)重要，補(bǔ)體C3處于補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑和旁路激活途徑的匯合點(diǎn)，且是補(bǔ)體系統(tǒng)中含量最高、最重要的成分，有著重要的生物學(xué)功能[11-12]。C3被激活后裂解產(chǎn)生的大片段C3b與細(xì)胞表面結(jié)合形成C5轉(zhuǎn)化酶，C5裂解產(chǎn)生的大片段C5b與C6～9形成C5b-9復(fù)合物，剩余部分在細(xì)胞表面結(jié)合形成MAC，從而溶解細(xì)胞[13]。補(bǔ)體系統(tǒng)活化狀態(tài)與補(bǔ)體活化產(chǎn)物循環(huán)有關(guān)[14]，有研究發(fā)現(xiàn)小鼠被敲除C3基因后，無法成功構(gòu)建EAMG模型，AChR抗體水平亦隨之降低，正常狀態(tài)下AChR抗體水平與B細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞因子表達(dá)密切相關(guān)，C3基因缺失小鼠NMJ突觸后膜上存在IgG沉積，但無補(bǔ)體C3和MAC，表明C3基因缺失可影響MAC介導(dǎo)的免疫損傷，亦可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，從而降低小鼠自身免疫反應(yīng)的機(jī)率[15]。在自身免疫性炎性反應(yīng)過程中TGF-β1可發(fā)揮多種作用[16]：①T、B淋巴細(xì)胞功能可被抑制；②可衰減或抑制炎性反應(yīng)，起負(fù)性調(diào)節(jié)；③可拮抗細(xì)胞炎性因子TNF-α，減少細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，使免疫下調(diào)，促進(jìn)炎癥修復(fù)。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)[17]TGF-β1含量在EAMG大鼠血清中較正常組低，且疾病嚴(yán)重時下降幅度更大。

補(bǔ)脾益腎起痿湯由補(bǔ)中益氣湯合二仙湯君藥組成，對辨證屬脾腎虧虛型肌無力(痿證)臨床療效顯著，遵循“治痿獨(dú)取陽明”原則。補(bǔ)中益氣湯是補(bǔ)益脾胃代表方，其功效為補(bǔ)益中氣、升陽舉陷，研究表明由補(bǔ)中益氣湯化裁的益氣升提方[18]可以減輕由Rα97-116免疫Lewis大鼠構(gòu)建的EAMG模型的臨床癥狀，其可能通過提高TGF-β含量而發(fā)揮療效。梁麗萍等[19]報(bào)道補(bǔ)中益氣湯通過降低IgG、升高補(bǔ)體C3的濃度治療氣虛發(fā)熱，張富強(qiáng)[20]報(bào)道：補(bǔ)中益氣湯可通過藥物間相互作用調(diào)節(jié)體液免疫應(yīng)答，進(jìn)而抑制AchRAb的產(chǎn)生，減輕神經(jīng)肌肉接頭功能損害，緩解肌無力癥狀。脾胃虧虛日久，造成腎陽虧虛，故加二仙湯君藥仙茅、仙靈脾，達(dá)到脾腎雙補(bǔ)作用。仙茅、仙靈脾可上調(diào)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1、IFN-γ及IL-5的含量[21]。徐鵬等[22]報(bào)道：補(bǔ)脾益腎藥物可以通過調(diào)控免疫相關(guān)細(xì)胞因子的變化，改善EAMG動物的臨床癥狀。對本研究結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)補(bǔ)脾益腎起痿湯通過下調(diào)人工合成免疫原制作實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)大鼠模型血清總IgG，上調(diào)TGF-β1、補(bǔ)體C3水平表達(dá)，降低血清AChR-Ab濃度，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，減輕肌無力癥狀。本研究從免疫調(diào)節(jié)角度探討補(bǔ)脾益腎方劑治療重癥肌無力的作用機(jī)理，這為中藥復(fù)方治療重癥肌無力提供了新的思路。