殼寡糖對大熊貓輪狀病毒VP6-VP7亞單位疫苗免疫作用的研究

文繼鋒，申歡歡，陰文奇，龔永平，易可可，鄧 英，顏其貴

(四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130)

輪狀病毒(rotavirus，RV)屬于呼腸弧病毒科(Reoviridae)、輪狀病毒屬(Rotavirus)，被劃分為7個不同的群(A～G)[1]。A群輪狀病毒是導致幼齡動物腹瀉的主要病原之一。幼齡大熊貓感染大熊貓輪狀病毒(giant panda rotavirus，GPRV)后，前期會出現食欲廢絕、急性嘔吐、體溫不高等癥狀，后期發展為水樣、蛋花樣腹瀉，糞便中含有大量的黏液和壞死腸黏膜[2]。GPRV是引起幼齡大熊貓發生非細菌性腹瀉的主要病原之一，對圈養大熊貓種群的擴大和健康產生了較大的影響。

RV基因組為分節段的雙股RNA，由11個節段組成，每1個節段編碼1個蛋白。RV包含6個結構蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)。VP7蛋白是由第9基因片段編碼，具有型特異性，是誘導機體產生中和抗體最主要的抗原蛋白[3]。VP6蛋白是由第6基因片段編碼，是RV的群及亞群抗原。在A群輪狀病毒中，VP6蛋白的編碼基因高度保守，且VP6蛋白具有良好的抗原性和免疫原性[4]。相關研究表明，VP6蛋白不僅是一種載體蛋白，在穩定結構蛋白VP7的空間結構和增強其免疫原性上起到作用，而且還可以介導黏膜免疫反應，刺激機體產生分泌型IgA(secretory IgA，sIgA)抗體。

殼寡糖(chitosan oligosaccharide，COS)又被稱為殼聚寡糖、低聚殼聚糖，是殼聚糖經過特殊的生物酶技術降解得到的聚合度在2～20之間的寡糖產品。殼寡糖的平均分子量為1～3 ku，價格低廉且具有較高的水溶性，易被機體吸收。COS作為一種新型的免疫佐劑，與傳統佐劑(油乳、水佐劑)相比，無毒性、生物刺激性小且具有良好的降解性，具有良好的應用價值[5]。相關研究表明，COS能夠增強機體的免疫應答水平，并且能夠增強亞單位疫苗的免疫效果[6]。同時，由于COS粒徑小，具有緩控、釋控作用，可有效延長疫苗作用時間，避免突釋，減輕或避免毒副反應，提高疫苗免疫效果[7]。本研究以重組表達的GPRV VP6-VP7蛋白為抗原，添加COS作為免疫佐劑，旨在研制一種新型的GPRV亞單位疫苗，并評估該亞單位疫苗的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

6～8周齡昆明小鼠78只，購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑

大腸埃希菌表達的重組GPRV VP6-VP7蛋白、GPRV CH-1株由本實驗室保存；殼寡糖由山東衛康生物醫藥有限公司惠贈；氫氧化鋁膠佐劑購自美國Sigma-Aldrich公司；小鼠IgA、IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ ELISA試劑盒購自杭州聯科生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 疫苗制備

稱取殼寡糖1.0 g，充分溶解于450 mL PBS中，定容至500 mL，使得終濃度為2.0 mg·mL-1。取GPRV重組蛋白VP6-VP7(濃度為2.05 mg·mL-1)3.078 mL、殼寡糖溶液2.700 mL倒入裝有5.022 mL PBS緩沖液的15 mL離心管中，利用勻漿機充分混勻后，分裝保存備用。同時，將重組蛋白GPRV VP6-VP7與氫氧化鋁膠佐劑按照1:1混合，充分乳化混勻后分裝保存備用。

1.3.2 小鼠免疫試驗

取6～8周齡的昆明小鼠78只，隨機分為4組，分別為：COS佐劑處理組(A，免疫接種VP6-VP7-COS混合物)、鋁佐劑處理組(B，免疫接種VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑混合物)、抗原對照組(PC，免疫接種VP6-VP7蛋白)、陰性對照組(NC，注射PBS溶液)。COS佐劑處理組、鋁佐劑處理組、抗原對照組小鼠各24只，陰性對照組小鼠6只，分別于0、15、30 d進行免疫接種。

1.3.3 相關免疫指標檢測

在首免后的14、28、42 d，各處理組中隨機選取6只小鼠采血，ELISA法檢測血清中的VP6-VP7抗體滴度、IgA抗體滴度和細胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ的含量。采用MTT法檢測T淋巴細胞轉化率。

1.3.4 小鼠免疫后攻毒保護試驗

在免疫后的第50天，隨機選取各處理組小鼠6只，每只小鼠注射GPRV病毒150 μL，注射后連續觀察6 d，每天觀察并記錄小鼠情況。

1.3.5 小鼠免疫后組織病理學分析

在免疫試驗的第58天，取每組小鼠注射部位的組織保存于4%多聚甲醛溶液中，然后將組織制作病理切片，采用蘇木精—伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察并記錄其病理變化。

2 結果與分析

2.1 小鼠血清IgG、IgA抗體水平

如表1所示，各免疫組小鼠血清中IgG、IgA抗體水平顯著(P<0.05)高于PBS組。在免疫后的14、28、42 d，鋁佐劑處理組、COS佐劑處理組小鼠的IgG和IgA抗體水平顯著(P<0.05)高于抗原對照組；在免疫后的14、28、42 d，COS佐劑處理組小鼠的IgA抗體水平顯著(P<0.05)高于鋁佐劑處理組。

表1 各組小鼠血清中IgG、IgA抗體滴度的變化

Table1IgG and IgA antibody titers in mice immunized with different vaccines

處理TreatmentIgG14 d28 d42 dIgA14 d28 d42 dA0.934±0.012 b1.243±0.027 b0.954±0.016 a0.291±0.027 a1.138±0.025 a0.982±0.019 aB1.643±0.021 a1.865±0.043 a0.732±0.027 b0.285±0.024 b0.786±0.053 b0.658±0.016 bPC0.412±0.023 c1.116±0.028 c0.543±0.033 c0.156±0.034 c0.184±0.029 c0.161±0.023 cNC0.102±0.015 d0.102±0.015 d0.105±0.013 d0.067±0.002 d0.069±0.006 d0.059±0.004 d

同列數據后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

The values in the same line with different lower-case letters showed significant differences (P<0.05). The same as below.

2.2 小鼠脾臟淋巴細胞增殖結果

試驗第44天，MTT法檢測小鼠脾臟中T淋巴細胞的增殖能力(表2)。VP6-VP7-COS物理混合組、VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑組和VP6-VP7蛋白組均能誘導小鼠脾臟T淋巴系統的增殖，且與PBS組差異顯著(P<0.05)。VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑組和VP6-VP7-COS物理混合組誘導T淋巴細胞增殖的能力顯著(P<0.05)高于VP6-VP7蛋白組。

表2 各組小鼠脾臟增殖檢測結果

Table2Results of spleen proliferation in mice of each group

分組ConANo-ConAA0.282±0.046 b0.150±0.016 aB0.472±0.023 a0.152±0.014 aPC0.184±0.024 c0.146±0.018 aNC0.158±0.022 d0.154±0.011 a

2.3 小鼠血清中細胞因子IL-2、IL-4、IL-5和IFN-γ含量

如圖1、2所示，在免疫后的14～42 d，VP6-VP7-COS物理混合組、VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑組和VP6-VP7組免疫小鼠血清中IL-2、IL-4含量均升高，且顯著(P<0.05)高于PBS對照組；VP6-VP7-COS物理混合組和VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑組小鼠血清IL-2、IL-4含量顯著(P<0.05)高于VP6-VP7組；VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑組小鼠血清中IL-2、IL-4含量顯著(P<0.05)高于VP6-VP7-COS物理混合組。

圖1 各組小鼠血清IL-2含量的變化Fig.1 Concentration of IL-2 in mice serum of each group

圖2 各組小鼠血清IL-4含量的變化Fig.2 Concentration of IL-4 in mice serum of each group

如圖3所示，在免疫后的14～42 d，VP6-VP7-COS物理混合組、VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑組和VP6-VP7蛋白組中免疫小鼠血清中IL-5含量均升高，且顯著(P<0.05)高于PBS組。VP6-VP7-COS物理混合組和VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑組小鼠血清IL-5含量顯著(P<0.05)高于VP6-VP7組；在免疫后42 d，VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑組小鼠血清中IL-5含量下降，且顯著(P<0.05)低于VP6-VP7-COS物理混合組。

圖3 各組小鼠血清IL-5含量的變化Fig.3 Concentration of IL-5 in mice serum of each group

如圖4所示，在免疫后的14～42 d，VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑組和VP6-VP7-COS物理混合組小鼠血清中IFN-γ含量顯著(P<0.05)高于VP6-VP7蛋白組和PBS對照組。免疫后28～42 d，VP6-VP7蛋白組小鼠血清中IFN-γ水平顯著(P<0.05)高于PBS組。在整個免疫期間，VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑組小鼠血清中IFN-γ水平顯著(P<0.05)高于VP6-VP7-COS物理混合組。

圖4 各組小鼠血清IFN-γ含量的變化Fig.4 Concentration of IFN-γ in mice serum of each group

2.4 小鼠免疫后攻毒保護試驗

每只小鼠接種150 μL GPRV病毒，6 d內觀察各組小鼠情況。VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑組小鼠0～6 d內精神狀態正常，食欲正常，未出現死亡； VP6-VP7-COS物理混合組小鼠攻毒后12 h內精神較差，后期正常，食欲正常，6 d內死亡1只，可能是由于疫苗接種過程中疫苗注射遺漏或者小鼠體質原因導致其抗體產生不足；VP6-VP7蛋白組小鼠攻毒后精神較差，后期3只精神較差，其余較好，食欲正常，6 d內死亡2只；PBS對照組小鼠在攻毒后全部死亡。結果表明，VP6-VP7-COS物理混合組和VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑組所產生的抗體均能對小鼠提供免疫保護。

2.5 小鼠免疫后組織病理學分析

如圖5所示，在免疫期間，PBS對照組、VP6-VP7-COS物理混合組在注射部位均沒有出現肉芽腫結節、潰爛等癥狀，同時病理切片上并沒有顯示任何炎癥反應。VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑組小鼠在免疫15 d后注射部位出現了明顯的肉芽腫性結節，免疫后期注射部位的皮膚出現潰爛，病理切片觀察可以看到明顯的炎性反應，中性粒細胞滲出，以及有殘留的油乳佐劑沒有被代謝。綜合以上分析表明，與油乳佐劑的副作用相比，殼寡糖作為免疫佐劑在起到免疫增強作用的同時并沒有表現出毒副作用。

圖5 免疫小鼠組織病理切片結果Fig.5 Histopathological sections of immunized mice

3 討論

大熊貓輪狀病毒主要導致幼齡大熊貓發生傳染性腹瀉，對于大熊貓種群的擴大會造成一定的影響。目前并沒有用于預防大熊貓輪狀病毒性腹瀉的疫苗。疫苗中的抗原與佐劑經過一定比例混合后，能夠更好的增強疫苗的免疫原性。但是，傳統佐劑(油乳、水佐劑)在使用過程中存在代謝速度慢，不易被機體充分吸收，注射部位形成肉芽腫、潰瘍等問題。因此，開發一種安全無毒副作用，且能夠起到免疫增強作用的新型疫苗佐劑，對輪狀病毒性腹瀉的預防具有重要的意義。殼寡糖可以與機體特定的受體結合激活免疫系統，從而發揮免疫調節作用，已經被證明具有免疫佐劑活性[8]。在輪狀病毒結構蛋白中VP6、VP7蛋白可以產生中和抗體，且VP6蛋白也被認為在適當的條件可介導黏膜免疫反應。因此，本研究選用GPRV VP6-VP7作為候選抗原，殼寡糖作為免疫佐劑，免疫小鼠后測定各項免疫指標，評估COS對重組蛋白VP6-VP7的免疫增強作用。

本試驗結果表明，GPRV VP6-VP7-COS亞單位疫苗提高了小鼠抗GPRV的中和抗體效價，雖然VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑組小鼠產生的中和抗體水平要高于VP6-VP7-COS組，但是在通過免疫小鼠的攻毒保護試驗后VP6-VP7-COS組免疫小鼠所產生的抗體也能夠提供免疫保護。中和抗體水平在評價動物機體特異性抵抗力時有著重要的參考價值。本研究證實COS作為免疫佐劑可以提高重組蛋白VP6-VP7誘導的中和抗體水平，所產生的抗體可以有效地中和GPRV，從而降低其對病毒的感染能力。

殼寡糖具有緩控、釋控的能力，可以延緩抗原成分在體內的釋放，并且可介導黏膜免疫反應。GPRV VP6蛋白不僅可以產生中和抗體，而且在適當的條件下刺激機體產生sIgA。因此，以殼寡糖作為佐劑的GPRV VP6-VP7蛋白亞單位疫苗在免疫小鼠后血清中IgA抗體的含量顯著增高。IL-5可以反應出IgA的表達水平，在本研究中通過對各組免疫小鼠血清中IL-5測定，得出VP6-VP7-COS組中IL-5含量顯著增加。綜合得出殼寡糖作為免疫佐劑可以有效地刺激機體產生IgA，從而介導機體的黏膜免疫反應。

T淋巴細胞的活性與體液免疫和細胞免疫反應密切相關。在本研究中將ConA作為非特異性刺激劑激活T淋巴細胞后，用以評價各免疫組對小鼠T淋巴細胞的增殖效果。結果顯示，在添加寡聚糖后提高了小鼠淋巴細胞的增殖活性，證實寡聚糖可以有效提高機體T淋巴細胞介導的免疫應答水平。

細胞因子參與免疫反應，在抗感染中起著重要作用[9]。Th1細胞產生IFN-γ、IL-2，可以促進細胞介導的免疫應答，其中IL-2可以間接反映細胞的免疫狀態。Th2細胞分泌IL-4，介導機體的體液免疫應答。因此，IL-2、IL-4和IFN-γ分泌可以間接反應機體的體液免疫和細胞免疫水平[10]。研究結果顯示，以寡聚糖為佐劑的GPRV VP6-VP7蛋白亞單位疫苗所產生IL-2、IL-4和IFN-γ含量低于VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑組，VP6-VP7-COS疫苗既可以刺激機體的體液免疫應答也可以刺激其細胞免疫應答。

選取VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑、VP6-VP7-COS物理混合組和PBS對照組小鼠注射部位的肌肉組織進行組織病理學分析，結果顯示，VP6-VP7-氫氧化鋁膠佐劑組的小鼠注射部位出現明顯的化膿性潰瘍、肉芽腫結節，但是VP6-VP7-COS物理混合組和PBS對照組沒有出現病理變化，表明殼寡糖作為佐劑在起到免疫增強作用的同時不會產生毒副作用。綜合以上，本研究結果為研制具有安全、無毒副作用和高免疫保護力的GPRV亞單位疫苗提供了研究依據。