中藥組方溶寧對(duì)急性溶血性貧血小鼠模型外周血及骨髓的影響

王漢海　曹慧　隋美霞　萬永霞　高順航

摘要：建立小鼠急性溶血性貧血模型并觀察中藥組方溶寧的治療效果，測(cè)定模型小鼠外周血和骨髓組織結(jié)構(gòu)的變化。將32只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、試驗(yàn)對(duì)照組和試驗(yàn)組，連續(xù)進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)以及石蠟切片和超微切片觀察。結(jié)果表明，中藥組方溶寧可改善外周循環(huán)血及骨髓細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，對(duì)溶血性貧血有一定的防治效果。

關(guān)鍵詞：溶寧;溶血性貧血;小鼠;骨髓

中圖分類號(hào)：R285? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）22-0149-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.035? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Influences of Chinese drugs rongning preparation on peripheral blood and bone marrow of mice with hemolytic anemia

WANG Han-hai，CAO hui，SUI Mei-xia，WAN Yong-xia，GAO Shun-hang

（Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology in Universities of Shandong Province/College of Bio-engineering and Agriculture，Weifang University，Weifang 261061，Shandong，China）

Abstract： To explore the mechanism of effect of Chinese drugs rongning preparation on hemolytic anemia mice by determination of the peripheral blood and bone marrow tissue structure. 32 kunming mice were randomly divided into blank control group， model group， control group and experimental group. The results showed that the rongning preparation can improve the peripheral blood and the ultrastructure of bone marrow cells， and have a precise curative effect on treating preventable hemolytic anemia through paraffin section method and continuous determination of the blood routine.

Key words： rongning; hemolytic anemia; mice; bone marrow

多種理化因素都可以誘發(fā)溶血性貧血（Hemolytic anemia，HA）[1]。利用鹽酸苯肼建立了小鼠急性HA模型[2，3]，方劑溶寧包括柴胡、黃芩、茵陳、半枝蓮等，觀察了在溶寧制劑和強(qiáng)的松的干預(yù)下，模型鼠外周血各項(xiàng)指標(biāo)的改變和骨髓的形態(tài)學(xué)改變。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗(yàn)動(dòng)物? 試驗(yàn)動(dòng)物為昆明小鼠，鼠齡8周，體重（22±3） g，由濰坊學(xué)院動(dòng)物中心提供，雌雄隨機(jī)，試驗(yàn)前適應(yīng)性飼喂3 d。

1.1.2? 試劑? 瑞氏色素為美國(guó)Sigma產(chǎn)品;鹽酸苯肼由上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站出品;溶寧制劑中藥材購(gòu)于濰坊市人民醫(yī)院中藥房。

1.2? 方法

1.2.1? 溶寧制劑的制備? 取雷公藤、茵陳、半枝蓮各15 g，柴胡、半夏、黃芩、甘草各10 g，黨參12 g[4，5]，洗凈后用500 mL自來水浸泡30 min，煮沸后文火煎煮20 min成200 mL湯劑;另加自來水400 mL煮沸后文火煎煮15 min成150 mL湯劑，兩次湯劑混合三層紗布過濾后文火至191.7 mL，其濃度為0.506 g/mL，置于4 ℃?zhèn)溆谩Ｈ軐幹苿┑呐R床口服用量為1.386 g/kg（5.48 mL/kg），按照人與小鼠的劑量換算系數(shù)0.002 6[6]，模型鼠用量為1.386 g/kg×70 kg×0.002 6=0.253 g，故試驗(yàn)時(shí)取0.506 g/mL溶寧制劑0.5 mL飼喂即可。

1.2.2? 試驗(yàn)分組? 試驗(yàn)用昆明小鼠共32只，隨機(jī)分為4組，每組8只。空白對(duì)照組：皮下注射生理鹽水（按3.3 mL/kg體重），喂服生理鹽水0.5 mL（每天處理1次，下同）;模型組：皮下注射0.1%鹽酸苯肼生理鹽水液（按3.3 mL/kg體重），喂服生理鹽水0.5 mL;試驗(yàn)對(duì)照組：皮下注射0.1%鹽酸苯肼生理鹽水液（按3.3 mL/kg體重），喂服強(qiáng)的松0.2 mL;試驗(yàn)組：皮下注射0.1%鹽酸苯肼生理鹽水液（按3.3 mL/kg體重），喂服溶寧制劑0.5 mL。

1.2.3? 切片制作? 分別于第2、4、6、8、10天每組隨機(jī)選取2只小鼠，取骨髓中性甲醛固定，斷尾檢測(cè)外周血;第10天處死后取骨髓部分用戊二醛和鋨酸雙固定制備超薄切片，剩下用中性甲醛固定制備石蠟切片。

1.2.4? 外周循環(huán)血象觀察? 75%乙醇溶液消毒后毛細(xì)吸管斷尾取血，紅、白細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定紅蛋白（Hb）含量和網(wǎng)織紅細(xì)胞（Retc）比值。

1.2.5? 光鏡和透射電鏡樣品[7]的制備? 試驗(yàn)第10天斷頭處死小鼠后剪斷后肢，紗布擦凈肌肉和結(jié)締組織，用1 mL注射器生理鹽水小心沖出骨髓，中性甲醛固定，常規(guī)制作石蠟切片，HE染色后顯微圖像采集分析系統(tǒng)（Scopeimage 9.0）整理分析圖片;另戊二醛、鋨酸雙固定，醋酸雙氧鈾及硝酸鉛染色，H-7500型透射電鏡下觀察并采集圖片。

1.2.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 所有數(shù)據(jù)以x±s表示。用Nosa統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行Dunnett-t檢驗(yàn)[8]，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，以P<0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 血液學(xué)指標(biāo)的改變

試驗(yàn)組與模型組比較，血常規(guī)中的紅細(xì)胞數(shù)和Hb含量升高，Retc比值降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性及極顯著性差異（P<0.05和P<0.01）;與試驗(yàn)對(duì)照組比較，試驗(yàn)組對(duì)血常規(guī)影響無顯著性差異（P>0.05）。且Retc比例隨苯肼用量的增加呈增大趨勢(shì)，但試驗(yàn)組和試驗(yàn)對(duì)照組Retc比例增高程度明顯小于模型組，且在用藥第8天開始有降低趨勢(shì)，而除空白對(duì)照組外，循環(huán)血白細(xì)胞數(shù)量都有明顯增加[3，9]（表1至表4）。

2.2? 中藥組方溶寧對(duì)骨髓細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2.1? 光鏡觀察結(jié)果? 光鏡下模型組骨髓內(nèi)見大小不等、形狀異常的成熟紅細(xì)胞（圖1A），試驗(yàn)組（圖1B）和試驗(yàn)對(duì)照組（圖1C）成熟紅細(xì)胞碎片較少，形態(tài)相近。

2.2.2? 電鏡觀察結(jié)果? 透射電鏡下空白對(duì)照組幼稚紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞核糖體和線粒體較多，核仁明顯;骨髓血竇內(nèi)皮細(xì)胞較完整，竇腔內(nèi)有較多紅細(xì)胞（圖2A）。模型組幼稚紅細(xì)胞表面突起較少，胞質(zhì)內(nèi)線粒體呈空泡樣變和髓樣變，血竇內(nèi)皮細(xì)胞局部斷裂，微絨毛較少，核周隙局部增寬（圖2B）。試驗(yàn)對(duì)照組（圖2C）和試驗(yàn)組（圖2D）幼稚紅細(xì)胞接近正常，血竇內(nèi)皮細(xì)胞較完整，試驗(yàn)對(duì)照組的內(nèi)皮細(xì)胞表面微絨毛最多。

3? 討論

方中柴胡和解表里，黃芩、茵陳清濕熱，黨參補(bǔ)氣血，組方主要有清濕熱、和脾胃、解表里、舒肝解瘀、補(bǔ)氣養(yǎng)血等功效[9]。內(nèi)在缺陷或外部因素都可破壞膜穩(wěn)定性使紅細(xì)胞崩潰造成HA，強(qiáng)的松可增加紅細(xì)胞膜穩(wěn)定性，降低HA的程度，使用溶寧制劑后循環(huán)血Retc比例降低，紅細(xì)胞數(shù)量和Hb含量降幅減小，說明溶寧制劑在增加膜穩(wěn)定性、刺激骨髓紅細(xì)胞系統(tǒng)或加速Hb的生成等對(duì)抗HA方面有一定作用。同時(shí)，通過白細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，除空白對(duì)照組外，其他各組白細(xì)胞數(shù)量都明顯升高，尤其表現(xiàn)在試驗(yàn)的第6～8天，這種現(xiàn)象在其他文獻(xiàn)中報(bào)道較少，很可能是鹽酸苯肼的毒性作用所致。在試驗(yàn)后期，白細(xì)胞數(shù)量有所下降，也說明強(qiáng)的松的抗炎作用和溶寧制劑在清濕熱、解毒方面的作用。

光鏡下正常骨髓組織內(nèi)見大量粒細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞;模型組顯示大量大小不等、形狀異常的成熟紅細(xì)胞，并可見紅細(xì)胞碎片;試驗(yàn)組和試驗(yàn)對(duì)照組成熟紅細(xì)胞碎片較少，形態(tài)接近正常，說明鹽酸苯肼對(duì)髓內(nèi)紅系細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[11]。

透射電鏡下空白對(duì)照組可見正常原紅細(xì)胞和中幼紅細(xì)胞，細(xì)胞器邊緣清晰，無脫顆粒現(xiàn)象;毛細(xì)血管表面可見大量微絨毛，內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)[12]。與空白對(duì)照組相比，模型組骨髓中紅細(xì)胞碎片增多，早幼紅細(xì)胞有線粒體受損現(xiàn)象，線粒體嵴模糊不清，中幼紅細(xì)胞線粒體電子密度增大，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)脫顆粒以及異染色質(zhì)增多的現(xiàn)象。線粒體密度、大小及嵴的豐富程度能直接反映細(xì)胞的生理功能狀態(tài)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒后會(huì)出現(xiàn)蛋白質(zhì)合成及運(yùn)輸障礙，電鏡檢測(cè)結(jié)果說明鹽酸苯肼可使紅細(xì)胞受損。試驗(yàn)對(duì)照組和試驗(yàn)組在透射電鏡下形態(tài)差別不大，骨髓內(nèi)紅細(xì)胞大多正常，中幼紅細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)多聚核糖體，毛細(xì)血管表面見大量微絨毛，內(nèi)皮細(xì)胞核周隙增寬現(xiàn)象不明顯，僅有少數(shù)出現(xiàn)空泡樣變，說明強(qiáng)的松和溶寧對(duì)骨髓的形態(tài)學(xué)改變與空白對(duì)照組比有較大改善。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張之南，沈? 悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].第二版.北京：科學(xué)出版社，1998.

[2] 王漢海.改良溶血性貧血?jiǎng)游锬Ｐ偷慕J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（34）：19533-19536.

[3] 張? 寧，史學(xué)娟.簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的網(wǎng)織紅細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法[J].中華臨床醫(yī)學(xué)研究雜志，2005，11（5）：723.

[4] 史大卓.中醫(yī)內(nèi)科辯證治療學(xué)[M].北京：科學(xué)技術(shù)出版社，1995.

[5] 黃才燮.常用中草藥識(shí)別與應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003.

[6] 辛先貴，張圣明，張春燕，等.中藥露蜂房蛋白對(duì)人紅白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞影響的試驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2005，6（12）：6-9.

[7] 李伯勤，張圣明.醫(yī)學(xué)超微結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[M].濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，2003.

[8] 王汝芬，陳景武，李建國(guó)，等.醫(yī)藥科學(xué)研究統(tǒng)計(jì)方法[M].濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，1994.

[9] 黃才燮.常用中草藥識(shí)別與應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003.

[10] 王漢海，萬永霞.中藥組方溶寧對(duì)急性溶血性貧血小鼠模型外周血及肝臟、脾臟的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（1）：195-197，298.

[11] 萬永霞，王漢海.甲醛對(duì)小鼠造血功能影響的試驗(yàn)研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（16）：3905-3907.

[12] 張圣明，李建華，崔為法，等.慢性再生障礙性貧血患者骨髓細(xì)胞形態(tài)的透射電鏡觀察[J].中華血液學(xué)雜志，1990，11（5）：253-254.