武漢地區禽大腸桿菌的分離、鑒定與耐藥模式探討

邵志勇　陳夏冰　楊文海　何斌　吳利軍　聶文豪　金爾光　陳潔　李佳琳　張翠麗

摘要：為了解武漢地區禽大腸桿菌（Escherichia coli）對常用抗生素的耐藥情況，采集疑似患病病雞進行大腸桿菌分離與鑒定，并對分離菌株進行藥物藥敏性分析。結果表明，從武漢地區11個養殖場115份樣品中分離到55株大腸桿菌，對青霉素（P）、氨芐西林（AMP）的耐藥率達到100%;對頭孢拉定（CED）、鏈霉素（STR）、氯霉素（C）、氟苯尼考（FFC）、四環素（TET）的耐藥率超過80%;對頭孢吡肟（FEP）、慶大霉素（GEN）、左氧氟沙星（LEV）最為敏感，耐藥率低于10%。55株大腸桿菌有12種耐藥譜，多重耐藥率高達94.55%，3重耐藥菌株占比為50.91%。

關鍵詞：禽;大腸桿菌（Escherichia coli）;分離鑒定;耐藥模式

中圖分類號：R378.2+1? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）22-0141-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.033? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Isolation and identification of avian Escherichia coli and its drug

resistance model in Wuhan district

SHAO Zhi-yong1，CHEN Xia-bing1，YANG Wen-hai1，HE Bin1，WU Li-jun1，NIE Wen-hao2，

JIN Er-guang1，CHEN Jie1，LI Jia-lin3，ZHANG Cui-li3

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Sciences，Wuhan Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430208，China;

2.Hubei Quansheng Ecological Agricultural Development Co.，Ltd.，Tianmen 431728，Hubei，China;

3.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Abstract： In order to grasp the resistance of E. coli to common antibiotics in Wuhan district， the suspected diseased chicken samples were collected for E. coli isolation and identification， and the drug isolates were analyzed for drug sensitivity.The results showed that 55 strains of E. coli were isolated from 115 samples from 11 farms in Wuhan， and their resistance rates to penicillin （P） and ampicillin （AMP） reached 100%; for cefradine （CED） and streptomycin （STR）， chloramphenicol （C）， florfenicol （FFC）， tetracycline （TET） resistance rate of more than 80%; for cefepime （FEP）， gentamicin （GEN）， levofloxacin （LEV）. The most sensitive， the resistance rate is less than 10%. There were 12 drug resistance profiles in 55 strains of E. coli， and the multi-drug resistance rate was as high as 94.55%， among which 3 resistant strains accounted for 50.91%.

Key words： avian; Escherichia coli; isolation and identification; drug resistance pattern

禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌（Escherichia coli）引起的禽類下痢、呼吸道感染和敗血癥等多種臨床表現的疾病。較常見的病癥有腹膜炎、輸卵管炎、心包炎、肝周炎、氣囊炎等。自1894年Ligniers首次報道了雞大腸桿菌病，世界養禽發達國家和地區相繼對該病不同病型進行了報道[1]。隨著集約化養禽業的迅速發展，致病性大腸桿菌對養禽業所造成的損失日益顯著[2]。

長期以來大腸桿菌病主要依賴抗菌藥物進行防控。抗菌藥物長期、大量的使用，導致大腸桿菌的耐藥菌株不斷出現，耐藥性不斷加強，耐藥譜不斷擴大，增加了對禽大腸桿菌病的防控難度。本研究對武漢地區疑似患大腸桿菌病的家禽進行大腸桿菌分離與鑒定，并對其進行藥物敏感性試驗，以了解禽大腸桿菌對常用抗菌藥物的耐藥情況，為指導禽大腸桿菌病的臨床用藥提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 病料來源? 病變樣品采集于武漢地區疑似患大腸桿菌病家禽的病變組織。

1.1.2? 主要藥品與試劑? 青霉素（P）、氨芐西林（AMP）、哌拉西林（TZP）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢哌酮（CFP）、頭孢吡肟（FEP）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢曲松（CRO）、頭孢拉定（CED）、頭孢氨芐（LEX）、慶大霉素（GEN）、鏈霉素（STR）、卡那霉素（KAN）、環丙沙星（CIP）、左氧氟沙星（LEV）、諾氟沙星（NOR）、洛美沙星（LOM）、氯霉素（C）、氟苯尼考（FFC）、四環素（TET）藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司。

麥康凱瓊脂培養基購自北京奧博星生物技術有限責任公司，伊紅美藍瓊脂（EMB）、MH營養瓊脂、大腸桿菌生化鑒定試劑盒購自青島高科園海博生物技術有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 引物的設計與合成? 根據GenBank中大腸桿菌phoA基因序列，使用Oligo7.0軟件設計通用引物，序列為phoA-F 5-CGATTCTGGAAATGGCAAA

AG-3，phoA-R 5-CGTGATCAGCGGTGACTATGA

C-3，引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.2.2? 菌株的分離純化與生化特性鑒定? 在無菌條件下，挑取疑似感染大腸桿菌的家禽病變組織接種于麥康凱瓊脂培養基、伊紅美蘭瓊脂培養基進行細菌分離，對分離純化的菌株進行革蘭氏染色與鏡檢，觀察細菌形態;同時，利用大腸桿菌生化鑒定試劑盒進行生化特性鑒定。

1.2.3? PCR鑒定? 對分離菌株進行菌液PCR鑒定，反應條件為94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環;72 ℃延伸10 min后16 ℃保存。預期擴增片段大小為720 bp，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上觀察并記錄電泳結果。

1.2.4? 藥敏試驗? 藥敏試驗根據美國臨床標準委員會（NCCLS）推薦的K-B瓊脂法進行。取待測菌株，涂布于麥康凱瓊脂培養基復蘇，挑取單個菌落接種于無菌TSB液體培養基，37 ℃恒溫搖床培養，與麥氏比濁管0.5比濁相同（菌液計數約1.5×108 CFU/mL）時，吸取100 μL菌液，用無菌三角推均勻涂布于MH平板上，每個平板貼5張藥敏試紙片，37 ℃恒溫箱培養16～20 h后，觀察并記錄。根據2018CLSI M100-ED28標準進行藥物敏感性結果判定，見表1。

根據多重耐藥（MDR）、泛耐藥（XDR）、全耐藥（PDR）多重耐藥菌暫行標準[3]，從6類抗菌藥物中各選出1種代表藥物，分別為P、CAZ、GEN、CIP、 C、TET，依據耐藥情況形成菌株多重耐藥譜進行多重耐藥菌株的判斷。

2? 結果與分析

2.1? 菌株的分離純化與生化特性鑒定結果

從115份樣品中分離到55株疑似大腸桿菌菌株，分離菌株在麥康凱瓊脂平板上形成粉紅色、圓形、隆起、光滑濕潤、邊緣整齊的中等大菌落（圖1a）;在伊紅美蘭瓊脂培養基上形成黑色菌落并帶有金屬光澤（圖1b）。革蘭氏染色鏡檢可見形態為紅色、兩端鈍圓的短桿菌，分離菌株為革蘭氏陰性菌（圖2）。

55株菌株在生化鑒定中都能發酵葡萄糖，能分解麥芽糖、乳糖、甘露醇、尿素;部分能夠分解蔗糖;吲哚試驗陽性，MR試驗陽性，VP試驗陰性，不產生H2S，不能利用枸櫞酸鹽;所有分離菌與大腸桿菌的生化特性相符。

2.2? PCR鑒定結果

對55株分離菌進行PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增目的條帶大小與預期片段一致，初步判定為大腸桿菌。部分菌株PCR擴增結果如圖3所示。

2.3? 藥物敏感試驗

55株大腸桿菌對20種常見抗菌藥物敏感性結果見表2。由表2可知，55株大腸桿菌對P、AMP的耐藥率最高，達100%;對CED、STR、C、FFC、TET的耐藥率超過80%;對FEP、GEN、LEV較為敏感，耐藥率為10%以下。

2.4? 禽大腸桿菌對6類抗菌藥物的耐藥譜

55株禽大腸桿菌耐藥譜有12類型，多重耐藥（3重及以上耐藥）率達94.55%（52/55）。其中，3重耐藥菌株占比最大，比例為50.91%（28/55），以P-GEN-TET耐藥譜占比最高，為21.82%（12/55）（表3）。

3? 討論

大腸桿菌廣泛存在于自然界中，作為一種常在菌，當外界環境改變時，可引發大腸桿菌病的暴發，對養殖業將會造成嚴重的經濟損失。長期以來，大腸桿菌病主要依賴抗菌藥物進行防控，70%獸用抗菌藥物被用作飼料添加劑，導致大腸桿菌的耐藥菌株不斷出現，耐藥性不斷增強，耐藥譜不斷擴大，以至于發病導致無藥可用[4]。

55株禽大腸桿菌對20種常用抗菌藥物存在不同程度的耐藥，頭孢菌素類（CED除外）、喹諾酮類耐藥率較低，青霉素類、氨基糖苷類（GEN除外）、酰胺醇類、四環素類耐藥率較高，其中酰胺醇類、四環素類抗菌藥物的耐藥率菌高于80%，與劉華棟等[5]和韋慶蘭等[6]對禽源大腸桿菌耐藥率的分析基本一致。此外，本試驗PG的耐藥率達到100%，但王曉姍等[7]研究結果表明，禽大腸桿菌對PG存在較高的敏感，與本試驗結果相反。劉璨穎等[8]對禽源致病性大腸桿菌的耐藥結果分析發現，大腸桿菌對CRO、GEN、CIP、NOR、LOM耐藥率較高，與本試驗中上述藥物的耐藥率較低，存在一定差異。大腸桿菌對多種抗菌藥物存在普遍耐藥，且耐藥率較高，可能是在養殖過程中濫用各類抗菌藥物，導致有效抗菌藥物越來越少;但個別抗菌藥物的使用其結果不盡相同，只是針對當地的大腸桿菌敏感，其他區域可能對該藥耐藥，分析原因可能是地域差異造成的。

本試驗中大腸桿菌對6類抗菌藥物的耐藥譜進行了分析，多重耐藥率高達94.55%，多重耐藥情況嚴重，其中以耐3～4種藥物的菌株為主。王佳等[9]對120株雞源大腸桿菌進行藥敏試驗，多重耐藥率高達100%，其中耐17種藥物的菌株占比為20.78%;馬建山[10]對82株雞源大腸桿菌進行耐藥試驗，多重耐藥率高達89.02%，其中耐4種藥物的菌株最多為31.70%，與本試驗的多重耐藥率接近。說明禽大腸桿菌耐藥情況比較嚴重，存在多重耐藥譜且耐藥譜復雜，臨床可選藥物越來越少，對大腸桿菌的防控越來越嚴峻。因此，指導抗菌藥物的科學使用，促進家禽養殖業向可持續性方向發展，保障人民身體健康具有重大意義。

參考文獻：

[1] 馬興樹，范翠蝶，夏玉龍.禽致病性大腸桿菌病研究進展[J].中國畜牧獸醫，2013，40（2）：169-174.

[2] 馬興樹.禽傳染病實驗室診斷技術[M].北京：中國化工出版社，2006.

[3] MAGIO RAKOS A P，SRINIVASAN A，CAREY R B，et al.Multidrug-resistant，extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria：An international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance[J].Clin Microbiol Infect，2012，18（3）：268-281.

[4] 陳敬雄，岳建雄.養殖業抗生素使用現狀及其對策[J].中國畜牧獸醫文摘，2013，29（5）：15-16.

[5] 劉華棟，唐? 娟，李婷婷，等.山西地區雞源性大腸桿菌分離株藥物敏感性分析[J].黑龍江畜牧獸醫，2018（5）：132-135，266.

[6] 韋慶蘭，張濟培，任? 濤，等.廣東地區水禽源大腸桿菌藥物敏感性分析[J].黑龍江畜牧獸醫，2015（12）：180-181.

[7] 王曉姍，李斯亮.禽大腸桿菌的分離與耐藥性分析[J].畜牧獸醫雜志，2018，37（6）：21-23.

[8] 劉璨穎，李建宏，梅啟定，等.禽源致病性大腸桿菌的耐藥性和毒力基因研究[J].中國家禽，2018，40（13）：21-25.

[9] 王? 佳，于? 杰，鄒? 玲，等.濰坊某雞場大腸桿菌耐藥性及血清型檢測[J].黑龍江畜牧獸醫，2018（22）：105-107.

[10] 馬建山.大連地區禽源大腸桿菌的分離、鑒定及藥物敏感性試驗[J].黑龍江畜牧獸醫，2018（10）：92-94.