蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Ｂｔｉ）發酵液的濃縮工藝研究

陳偉　廖先清　劉芳　饒犇　周榮華

摘要：通過對蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis，Bti）發酵液濃縮工藝的研究，探索了不同溫度對濃縮液有效成分的影響程度，比較了不同濃縮方式、不同干燥方式處理下有效成分的回收率。結果表明，采用真空薄膜濃縮方式最終得到的產物質量是離心濃縮方式得到產物質量的176%，效價回收率提高了36%。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis）;真空薄膜濃縮;離心濃縮

中圖分類號：Q813.1? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）22-0111-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.025? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Studies on concentration process of BTi fermentation broth

CHEN Wei，LIAO Xian-qing，LIU Fang，RAO Ben，ZHOU Rong-hua

（Hubei of Biopesticide Engineering Research Center，Wuhan 430064，China）

Abstract： Through the study on the concentration process of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis（Bti） fermentation broth， the effects of different temperatures on the active components of the concentrate were explored. The recovery rates of the active components under different concentration methods and different drying methods were compared. The results show that the quality of the product finally obtained by the vacuum film concentration method is 176% of the mass of the product obtained by centrifugal concentration， and the recovery rate of the potency is increased by 36%.

Key words： Bacillus thuringiensis subsp. israelensis; vacuum film concentration; centrifugal concentration

蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis，簡稱Bti）是Goldberg和Margalit于1977年發現的一種對蚊科幼齡害蟲具有高度毒力的病原細菌。自發現以來，人們利用Bti制劑為控制蚊媒病的傳播進行了大量工作。

目前Bti常規的生產方法是采用相關的芽孢桿菌生產菌種，分批發酵培養，至其大部分或者全部形成芽孢時，采用板框過濾或者離心的方式進行濃縮，添加助劑后烘干或者噴霧干燥得到芽孢桿菌的活菌制劑[1-5]。這些方法存在著嚴重的不足，發酵液的濃縮采用的絮凝/板框過濾或者離心技術一般都會產生大量的廢水，后續處理成本較高;采用絮凝/板框過濾或者離心技術還會造成發酵液上清里的有效成分丟失，產品質量下降。而且傳統的絮凝/板框過濾或者離心濃縮方法會產生大量生化需氧量（BOD）很高的廢水，需要進行復雜的處理才可能達到排放標準。因此，有必要對芽孢桿菌發酵液后處理的工藝進行研究，以達到提高后處理過程中芽孢及其所產生的活性物質的收率，減少后處理工藝所產生的廢水泊BOD[6-12]。而采用真空薄膜濃縮后，優點在于直接濃縮發酵液，相比于傳統的絮凝/板框過濾或者離心濃縮方式，發酵液中可溶性的增效物質、促生物質、抑菌活性物質等得到有效回收。低溫濃縮過程中產生的冷凝水，生化需氧量極低，一般在80以下，達到排放標準。

本研究在前期其他芽孢桿菌濃縮工藝研究的基礎上，詳盡研究了蘇云金芽孢桿菌以色列亞種NBIM-301的濃縮工藝，主要是濃縮條件和回收率的研究。

1? 材料與方法

1.1? 材料

菌種：蘇云金芽孢桿菌以色列亞種NBIM-301系湖北省生物農藥工程研究中心分離并保存;發酵液由湖北省生物農藥工程研究中心工程技術研究室提供。

儀器：真空薄膜濃縮器（蒸發量30 L/h）、LGJ-200F型冷凍干燥機、噴霧干燥塔（蒸發量10 L/h），黑龍江大三源乳品機械有限公司;Eppendorf 5424型離心機，艾本德中國有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 真空薄膜濃縮? 取5 L發酵液加入真空薄膜濃縮器進料容器中，經加熱器加熱到設定溫度后送至分離器，在真空度-90～-80 kPa下進行蒸發和分離，蒸氣通過冷凝器冷凝成水后排出，濃縮后的物料取出后通過不同方式進行干燥。

1.2.2? 離心濃縮? 取5 L發酵液加入管式離心機，在18 000 r/min轉速下進行離心分離，倒掉上清液，取出沉淀通過不同方式進行干燥。

1.2.3? 冷凍干燥? 將濃縮物放入冷凍干燥機中24 h，待完全干燥后取出，稱重后備用。

1.2.4? 噴霧干燥? 將濃縮物在進口風溫150 ℃、塔內溫度60 ℃條件下進行噴霧干燥，收集稱重后備用。

1.2.5? 分析檢測? 以色列亞種NBIM-301采用GB/T19567.1-2004中生物測定法測定生物效價。

1.2.6? 總有效成分計算方法? 總有效成分=生物效價×質量。

1.2.7? 有效成分回收率計算? 有效成分回收率=不同處理的產物質量×產物生物效價×100/發酵液直接凍干的產物總有效成分。

1.2.8? 工藝廢水化學需氧量和5 d生化需氧量檢測? 取離心濃縮上清液和真空薄膜濃縮冷凝液各5 L送武漢市環境監測中心委托檢測，采用GB11914-1989、HJ505-2009兩項標準中的方法進行。

2? 結果與分析

2.1? 最適濃縮溫度

NBIM-301的結果表明，50 ℃和60 ℃處理后，效價差異在10%以內但60 ℃溫度更高，濃縮所需的時間更少，分離效率要高于50 ℃。70 ℃處理時產品效價很低（表1）。

進一步研究了55、60、65 ℃條件下的濃縮試驗，結果表明，雖然65 ℃效價比60 ℃時要低，但65 ℃溫度更高，濃縮所需的時間更少，濃縮效率高（表2）。

2.2? 不同濃縮方式的產物回收率

與其他蘇云金芽孢桿菌的濃縮試驗不同，由NBIM-301的發酵液直接真空薄膜濃縮得到的產物效價相比于離心濃縮處理得到的產物效價（5 233 ITU/mg）稍高一些，這是由于NBIM-301的晶體較小，離心濃縮會損失一部分晶體，而將兩種處理方式得到的濃縮液凍干或者噴霧干燥后，前者得到的產物質量要大于后者。不管用什么溫度進行蒸發濃縮，所得到的濃縮液的固含量是一致的，仍以1 t發酵液為例，分別計算以真空薄膜濃縮（65 ℃）和離心濃縮兩種方式回收到的產物量，結果見表3。由表3可知，采用真空薄膜濃縮方式最終得到的產物質量是離心濃縮方式得到的產物質量的176%，效價回收率提高了36%。

3? 討論

蘇云金芽孢桿菌發酵液后處理的核心問題就是將伴孢晶體等殺蟲成分及其增效因子與發酵液分離，除去占質量90%以上的水分，得到干燥的工業原粉。為了不破壞發酵液的殺蟲活性，濃縮過程要遵循“低溫、快速”的原則，而減壓濃縮法是在較低溫度下將發酵液濃縮到一定體積的方法，正好能夠符合該原則和要求，而目前MVR和降膜蒸發器的技術則降低了能耗和提高了效率，促進了該技術的實際應用。從原理上講，溫度越低越有利于伴胞晶體和生物有效物質的回收，但是溫度太低則會導致生產效率的降低和成本增加，所以在選擇具體工藝時需要綜合考慮。而根據本試驗研究結果，65 ℃是正好能保證回收效率和效果比較合適的溫度，在該溫度下最終得到的產物質量是離心濃縮方式得到的產物質量的176%，效價回收率提高了36%。

當然，真空薄膜濃縮也有一些不足之處，一是有效成分含量的下降，二是后續劑型加工會受到影響。這些都需要對工藝進行進一步的優化和改善，以得到最優的工藝。

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