不同施肥模式對茶園土壤細菌多樣性的影響

毛迎新　黃丹娟　王紅娟　譚榮榮　陳勛　王友平

摘要：以菜子餅+茶葉配方肥（YSJF1）、脲甲醛緩釋肥（YSJF2）、茶葉配方肥（YSJF3）、畜禽糞商品有機肥+茶葉配方肥（YSJF4）、菜子餅+脲甲醛緩釋肥（YSJF5）、包膜控釋肥（YSJF6）、茶葉復混肥（YSJF7）、不施肥（YSJF8）和習慣施肥（YSJF9）處理后的茶園土壤為研究對象，利用Ion S5TMXL高通量測序技術，以16S rRNA基因為靶標，研究不同施肥模式對茶園土壤細菌數量、多樣性和群落結構的影響，分析細菌數量、多樣性與土壤理化性質的關聯性。在門分類水平上，27個樣品共鑒定獲得46個類群，其中變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、奇古菌門（Thaumarchaeota）、擬桿菌門（Bacteroidetes）為優勢類群，相對豐度占87.08%～96.76%。不同施肥處理間變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門的相對豐度差異顯著。不同施肥處理的ACE指數、Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數分別為656.34～962.36、655.79～1 040.41、5.22～6.54和0.925 0～0.969 3。相關性分析和冗余分析結果表明，土壤pH、有機質含量和堿解氮與細菌豐度、α多樣性指數和細菌群落結構有一定的相關性，土壤pH是影響細菌群落重要的環境因子。

關鍵詞：茶園;施肥模式;細菌菌落多樣性;16S rRNA

中圖分類號：S154.3? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）22-0065-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.015? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of different fertilization managements on tea garden soil bacterial diversity

MAO Ying-xina，HUANG Dan-juana，WANG Hong-juana，TAN Rong-ronga，CHEN Xuna，WANG You-pingb

（a.Institute of Fruit and Tea;b.Institute of Plant Protection and Soil Fertilizers/Key Laboratory of Integrated Pest Management Crops in Central China，Ministry of Agriculture，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract： A field trial was conducted in tea plantation， nine different soil samples were collected， including rapeseed cake fertilizer and tea formula fertilizer（YSJF1）， urea-formaldehyde slow released fertilizer（YSJF2）， tea formula fertilizer（YSJF3）， animal manure and tea formula fertilizer（YSJF4）， rapeseed cake fertilizer and urea-formaldehyde slow released fertilizer（YSJF5）， coated controlled release fertilizer（YSJF6）， tea compound fertilizer（YSJF7），no fertilization（YSJF8）， and the chemical fertilizer（YSJF9）. Using Ion S5TMXL high-throughput sequencing technology， targeting the 16S rRNA gene， the effects of different fertilization patterns on the number， diversity and community structure of soil bacteria in tea plantation， and the correlation between the number， diversity and soil physical and chemical properties was analyzed. At the phylum level， forty-six phyla were obtained in all the treatments， among which Proteobacteria， Acidobacteria， Actinobacteria， Chloroflexi， Firmicutes， Thaumarchaeota and Bacteroidetes were the common dominant bacteria， accounting for 87.08%～96.76% of the total reads. There were significant differences in relative abundance of Proteobacteria， Acidobacteria， Actinobacteria and Chloroflexibetween among different treatments. The index of Ace， Chao1， Shannon and Simpson were 656.34～962.36， 655.79～1 040.41， 5.22～6.54 and 0.925 0～0.969 3， respectively. Correlation analysis and redundancy analysis showed that soil pH， organic matter content and alkali-hydrolyzed nitrogen were correlated with bacterial abundance， alpha diversity index and bacterial community structure， and soil pH was an important environmental factor affecting bacterial community.

利用Uparse軟件（Uparse v7.0.1001）[10]對所有樣品的全部有效數據進行聚類，以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為操作分類單元OTUs（Operational Taxonomic Units），篩選OTUs中出現頻數最高的序列作為OTUs的代表序列。

用Mothur方法與SILVA132（http：//www.arb-silva.de/）[11]的SSUrRNA數據庫[12]進行物種注釋分析（設定閾值為0.8～1.0），獲得分類學信息并分別在各個分類水平統計各樣本的群落組成。使用MUSCLE[13]（Version 3.8.31，http：//www.drive5.com/muscle/）軟件進行快速多序列比對，得到所有OTUs序列的系統發生關系。最后對各樣品的數據進行均一化處理，以樣品中數據量最少的為標準進行均一化處理，后續的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數據。

1.4? 數據處理

利用SPSS 22.0對土壤理化性質、細菌16S rRNA相對豐度、多樣性指數等數據進行多重比較、方差分析和相關性分析;環境因子對細菌群落結構影響的冗余分析采用R3.3.2軟件完成。

2? 結果與分析

2.1? 土壤樣品測序結果

利用Ion S5TMXL平臺對細菌16S rRNA基因的V3-V4區測序，27個土壤細菌樣品通過對Reads剪切過濾，平均每樣品測得83 166條Reads，經過質控平均得到78 142條有效數據，平均長度為407.93 bp，質控有效率達94.01%。以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為OTU（Operational taxonomic units），共得到4 173個OTU。樣品OTU稀釋曲線趨向平坦，說明測序數據量合理（圖1）。

2.2? 不同施肥模式對土壤細菌群落組成的影響

在97%相似性閾值下，9個處理（YSJF1至YSJF9）分別聚類為2 578、2 377、2 547、2 994、2 779、2 789、2 986、3 027和1 706個細菌OTU（表2）。不同處理間共有的OTU數目為789個，代表性的物種分別屬于γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、酸桿菌綱（Acidobacteriia）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、Nitrososphaeria、酸微菌綱（Acidimicrobiia）、纖線桿菌綱（Ktedonobacteria）、擬桿菌綱（Bacteroidia）等。不施肥處理不含有其獨有的細菌OTU。與不施肥處理相比，YSJF1、YSJF6施肥處理均增加了纖維桿菌綱（Fibrobacteria）、甲烷微菌綱（Methanomicrobia）等細菌物種;YSJF2施肥處理增加了Rhodothermia等物種;YSJF3施肥處理增加了其獨有未歸類的螺旋體綱的細菌（unidentified_Spirochaetes）;YSJF4施肥處理增加了互營養菌（Synergistia）等菌群;YSJF5施肥處理增加了未歸類的泉古菌門的細菌unidentified_Crenarchaeota等;YSJF7施肥處理增加了甲烷桿菌綱（Methanobacteria）、Chitinivibrionia、unidentified_Zixibacteria等獨有的細菌物種;YSJF9處理增加了互營養菌、Rhodothermia等物種;同時施肥處理也存在細菌物種的減少，如習慣施肥處理減少了全噬菌綱（Holophagae）、未歸類的古細菌unidentified_Archaea等6個細菌物種。

2.3? 不同施肥模式對土壤細菌相對豐度的影響

在門分類水平上，共鑒定獲得46個類群，其中，變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、奇古菌門（Thaumarchaeota）、擬桿菌門（Bacteroidetes）為優勢類群，相對豐度分別為30.45%～61.59%、5.85%～27.42%、2.34%～23.40%、0.74%～14.48%、0.11%～14.41%和0.93%～13.62%，相對豐度共占87.08%～96.76%（圖2）。

不同施肥模式間變形菌門（P<0.05）、酸桿菌門（P<0.01）、放線菌門（P<0.01）、綠彎菌門（P<0.001）的相對豐度差異顯著。調查發現，YSJF1處理組放線菌門高于其他處理組，綠彎菌門顯著高于其他處理組，擬桿菌門則低于其他處理組。YSJF9處理組變形菌門顯著高于其他處理組，但其放線菌門、綠彎菌門、奇古菌門和芽單胞菌門則低于其他處理組。

在綱分類水平上，共鑒定獲得59個綱，γ-變形菌綱、酸桿菌綱、α-變形菌綱、Nitrososphaeria、酸微菌綱、纖線桿菌綱、擬桿菌綱為主要優勢類群，相對豐度分別為15.14%～52.96%、5.57%～24.75%、8.54%～23.20%、0.11%～14.16%、1.16%～13.59%和0.39%～12.32%，相對豐度共占63.68%～80.10%（圖3）。

不同施肥模式間嗜熱油菌綱（P<0.05）、酸桿菌綱（P<0.01）、γ-變形菌綱（P<0.001）、酸微菌綱（P<0.001）、纖線桿菌綱（P<0.001）的相對豐度差異顯著。YSJF1處理組酸微菌綱、梭菌綱（Clostridia）均高于其他處理組，纖線桿菌綱顯著高于其他處理組，擬桿菌綱則低于其他處理組。YSJF9處理組擬桿菌綱高于其他處理組，γ-變形菌綱顯著高于其他處理組，但其酸微菌綱、纖線桿菌綱和嗜熱油菌綱則低于其他處理組（圖3）。

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