豬脾轉移因子注射液熱原檢查研究

徐 磊 朱曉瑋 周永銀 許秀梅 杜 君 劉小龍 賴隆永 林祚貴 黃 瑜

（1.福建農業職業技術學院 福州 350119；2.南京天邦生物科技有限公司 南京 211102；3.派生特（福州）生物科技有限公司 福州 350500；4.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所 福州 350013）

轉移因子（Transfer Factor，TF）是白細胞中具有免疫活性的T淋巴細胞所釋放的一類可透析小分子物質，屬于多肽類物質，其肽分子比蛋白質小很多，具有效果顯著、作用迅速、無抗原性、使用安全、無毒副作用、無藥物殘留等優點[1-3]，被廣泛運用于人類和獸醫臨床領域，具有十分重要的理論研究和應用價值[4-11]。熱原是微生物的代謝產物，是可引起人、豬、雞等恒溫動物體溫異常升高的致熱物質[12]。熱原檢查法作為檢查熱原的一種基準方法，系將一定劑量的待檢樣品經靜脈注入兔體后，觀察家兔體溫的升高情況，以判定待檢樣品所含熱原限度是否符合規定，半個多世紀以來一直被廣泛用于藥品和生物制品的熱原檢查，為醫藥安全作出了巨大貢獻[13-14]。

為了建立TF的熱原檢查方法及對其制造工藝進行驗證，本試驗按照課題組已授權國家發明專利制備3批TF[15-17]，通過熱原檢查法對3批TF進行熱原檢查研究，以期明確發明專利制造工藝對熱原的去除效果，為獸用TF的規模化制備提供相關試驗參考。

1 材料和方法

1.1 試驗動物 家兔購自福建省連江劉氏兔業養殖場，經檢驗符合現行《中國獸藥典》附錄“熱原檢查法”供試用家兔要求，即試驗用家兔體重1.7 kg以上，健康合格，雌兔無孕。試驗前7 d，體重無減輕，食欲、排泄、精神等無異常現象。

1.2 TF制備 參照本課題組已授權的國家發明專利制備3批TF[15-17]：以健康豬脾臟為原料，經勻漿、細胞破碎、滅活、微濾、超濾后精制而成，3批TF分別為TF-1、TF-2、TF-3。 經檢驗，所制備 3批TF的pH值分別為6.88、6.92和6.96，多肽含量分別為2.92 mg/mL、2.68 mg/mL 和 2.60 mg/mL，核糖含量分別為 59.8 μg/mL、58.4 μg/mL 和 56.3 μg/mL，脫 E 受體法效力分別為15.7%、15.4%和17.1%，細菌內毒素含量均不超過10 EU/mL，在250～260 nm處有最大吸收峰（均為253 nm），OD260nm/OD280nm的比值均大于 1.9（分別為 2.29、2.30和 2.32），外源病毒檢驗、支原體檢驗、無菌檢驗、蛋白質定性檢驗、過敏反應檢查、異常毒性檢查、安全檢驗均合格。

1.3 試驗設計 取家兔9只，隨機分成3組：第1組、第2組和第3組，每組3只家兔，分別編號1～9。選取TF-1、TF-2和TF-3作為待檢樣品，分別以0.5 mL/kg劑量經耳靜脈緩緩注入第1組、第2組和第3組家兔，開展熱原檢查試驗，試驗設計見表1。

表1 熱原檢查試驗設計

1.4 熱原檢查試驗

1.4.1 試驗前準備 與待檢樣品接觸的試驗用器皿為無菌、無熱原器皿。在開始熱原檢查試驗前1 d，家兔處于同一溫度的環境中，飼養室和實驗室的溫度相差不大于3℃，且控制在17～25℃，在試驗過程中，實驗室溫度變化不大于3℃，并防止動物騷動及避免噪聲干擾。家兔在試驗前2 h停止給食，并置于寬松適宜的裝置中至試驗完畢。肛溫計（精密度為±0.1℃）插入肛門的深度及時間各兔均一致，其中，深度約6 cm，時間2 min，每隔30 min測量體溫1次，共測量2次，兩次體溫之差不高于0.2℃，兩次體溫平均值作為該兔的正常體溫。且正常體溫在38～39.6℃范圍，同組各兔間的正常體溫之差不高于1℃。

1.4.2 檢查法 在測定家兔正常體溫后15 min內，經耳靜脈緩緩注入0.5 mL/kg劑量并溫熱至約38℃的待檢樣品，然后每隔30 min測量1次，共測量6次，以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔體溫的升高溫度 （當家兔升溫為負值時以0℃計）。如果3只家兔中有1只體溫升高不低于0.6℃，或3只家兔體溫升高的總和不低于1.3℃，應另取5只家兔進行重檢，檢查方法同上。

1.4.3 結果判斷 在首免的3只家兔中，體溫升高均低于0.6℃，并且3只家兔的體溫升高總和低于1.3℃；或在重檢的5只家兔中，體溫升高不低于0.6℃的家兔不超過1只，并且首免、重檢合并8只家兔的體溫升高總和不高于3.5℃，均判定待檢樣品的熱原檢查結果符合規定。

在首免的3只家兔中，體溫升高不低于0.6℃的家兔超過1只；或在重檢的5只家兔中，體溫升高不低于0.6℃的家兔超過1只；或在首免、重檢合并8只家兔的體溫升高總和高于3.5℃，均判定待檢樣品的熱原檢查結果不符合規定。

2 結 果

按試驗方法進行操作，測得各家兔正常體溫和升高體溫，結果見表2。結果顯示，待檢樣品注射后各家兔的體溫升高值均小于0.6℃，且各組的3只家兔體溫升高值總和均小于1.3℃。因此，判定3批TF的熱原檢查結果均符合現行《中國獸藥典》規定。

表2 熱原檢查結果

3 討 論

在醫學發展史上，注射給藥方式的創立是一個重大的進步，其在人類與疾病斗爭過程中發揮著重要作用。但是至今，臨床上常因輸注藥液而引起機體出汗、高熱、嘔吐、昏迷甚至危及生命，被稱為熱原反應[18]。

熱原是能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質，其在機體作用于體溫調節中樞，使機體散熱減少、產熱增加，表現出體溫上升等熱原反應。細菌內毒素脂多糖被認為是最主要的熱原，所有已知的細菌內毒素脂多糖均具有很強的熱原活性。當前，常用的熱原檢測方法主要有細菌內毒素檢測法（鱟試劑）和家兔法。其中，家兔熱原檢測法的優點是能夠反映熱原所引起哺乳動物復雜的升溫過程，該方法不僅可檢測出細菌內毒素的致熱原，而且能檢查出非細菌內毒素的致熱原，適用于較多種類的熱原物質檢查[19-20]。

自20世紀50年代發現TF至今，TF作為具有非特異性活性和特異性免疫活性的細胞調節因子，國內外學者對其開展了大量研究[21-27]。本試驗按照現行《中國獸藥典》附錄“熱原檢查法”，對本課題組已授權國家發明專利所制備的3批TF開展熱原檢查研究，結果顯示，3批TF的熱原檢查結果均符合現行《中國獸藥典》規定，表明本發明專利制造工藝可有效去除熱原，保證TF制品的安全性。