釀酒酵母PDEs基因缺失對藍莓果酒抗氧化及揮發性物質的影響

馬國為，姚 婷，談太聰，何欣萌，張亮然，王友升,*

(1.北京工商大學 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100048；2.山東大學 微生物技術國家重點實驗室，山東 濟南 250100)

藍莓果實富含礦物質、微量元素、維生素以及多酚類物質等，具有抗氧化、保護視力、增強心臟功能、軟化血管、增強人體免疫力等功能[1-2]。藍莓生產的季節性和區域性限制了藍莓的貯藏和銷售，因此藍莓的生產和加工引起了生產者和消費者的廣泛關注[3]。藍莓果酒的加工不僅解決藍莓儲藏的問題，還可以有效保留果實原有的營養價值，提高其附加值[4]。在果酒釀造過程中，釀酒酵母菌種、糖度、酸度、溫度和SO2濃度是影響果酒發酵質量的重要因素[5]。已有研究表明，酵母菌種是影響果酒風味的關鍵因素之一[6]。

釀酒酵母的生存活力以及發酵特性主要受高酒精度、高滲透壓、氧化脅迫、低pH值等脅迫條件的影響[7]；而釀酒酵母內環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)和環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)信號轉導通路在調控細胞的增殖、分化、代謝以及對脅迫條件的抗性發揮著至關重要的作用[8]。環核苷酸磷酸二酯酶(cyclic nucleotide phosphodiesterase，PDEs)通過自身的磷酸化調節細胞內第二信使cAMP或cGMP的信號傳導過程[9]。PDEs超家族可分I型和II型兩大類，酵母中含有yPDE1(Ⅱ型)和yPDE2(Ⅰ型)兩種PDEs，yPDE1和yPDE2在酵母細胞中發揮著不同的生理功能[10-11]。在對cAMP/cGMP信號通路調控釀酒酵母生存活力的研究中發現，yPDE1在反饋抑制葡萄糖誘導的cAMP信號通路發揮著特定功能[12]，yPDE2過量表達可提高酵母對氧化脅迫和酒精脅迫的耐受性[13-14]。由此可見，PDEs基因缺失能夠影響釀酒酵母的活性。已有研究表明，PDEs突變菌株能提高果酒發酵速率[15]，但對于利用PDEs基因缺失的釀酒酵母進行藍莓果酒發酵特性的研究目前未見相關報道。

本研究擬采用藍莓果實為原料，通過比較野生型釀酒酵母與PDEs基因缺失菌株釀造的果酒理化特性、抗氧化能力、活性物質和揮發性物質含量，探究PDE1和PDE2基因對釀酒酵母的發酵特性的影響，以期為篩選優良釀酒酵母提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1實驗材料

菌株：野生型釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，為本實驗室保存菌株。結合同源重組原理和醋酸鋰酵母高效轉化實驗進行基因敲除。PDE1和PDE2基因單拷貝敲除菌株分別為PDE1/Δpde1和PDE2/Δpde2突變菌株，PDE1和PDE2基因雙拷貝敲除菌株分別為Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2突變菌株。

藍豐藍莓：山東藍莓生產基地提供，藍莓初始可溶性固形物含量(SSC)為10.6°Brix，總酸質量濃度為6.87 g/L。

1.1.2實驗試劑

引物由Invitrogen公司負責合成；DNA分子質量標準2×TaqPCR Master Mix、6×loading buffer(溴酚藍)以及MarkerⅦ，天根生化試劑公司；Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes、polyethylene glycol和lithium acetate dihydrate，美國Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷(tris methyl aminomethane，Tris)、hygromycin B、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、G418 sulfate、Triton-X100和乙二胺四乙酸鈉(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，美國Amresco公司；偏重亞硫酸鉀、偏重亞硫酸鈉、果膠酶(30 000 Da)等均為食品級，上海和氏璧化工有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、結晶紫、葡萄糖等均為分析純；酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂均為生物試劑。

1.2 儀器與設備

HQ45型恒溫搖床，武漢中科科儀技術發展有限公司；5810R型高速離心機，美國Eppendorf公司；生物安全柜，美國Thermo公司；PCR儀，美國Bio- Rad公司；QP2010型氣相色譜- 質譜聯用儀，日本島津公司；PC- 420D型固相微萃取工作臺，Corning 公司；PR- 201型數字式糖度計，上海右一公司；Mole-cular Devices SpectraMax 190型酶標儀，上海艾研生物科技有限公司；T6型新世紀分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1藍莓果酒釀造

挑選成熟度高、無腐爛變質的新鮮藍莓，用清水洗凈、打漿。向果漿中加入100 mg/L果膠酶，酶解2 h，用紗布過濾除去殘渣，添加蔗糖將藍莓汁的SSC調至22°Brix。藍莓汁中加入200 mg/L偏重亞硫酸鉀進行4 h殺菌，最后將野生型釀酒酵母(WT)及4株PDE1/Δpde1、Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2突變菌株分別接種到等量藍莓汁中，接種量均為2×107CFU/mL。將發酵罐放置在20 ℃條件下進行恒溫發酵，每天攪拌2次。發酵結束后，將藍莓酒進行皮渣分離，果酒濾液密封保存進入陳釀期，陳釀結束后再進行過濾灌裝即得成品。

1.3.2藍莓果酒發酵特性測定

1.3.2.1 理化指標測定

pH：采用酸度計測。總酸：采用堿式滴定法測定。酒精度：采用比色法測定[16]。糖度：采用硫酸- 苯酚比色法測定[17]。每項測定各重復3次。

1.3.2.2 抗氧化能力測定

DPPH自由基清除能力的測定參考文獻[18]方法；羥自由基清除能力的測定參照文獻[19]方法；ABTS自由基清除能力的測定參考文獻[20]方法。各項實驗均將自由基清除率為50%定義為1個活性單位(U)，樣品自由基清除能力表示為單位質量(g)新鮮樣品中含有的活性單位(U/g)。

1.3.2.3 活性物質含量測定

總酚的測定參照文獻[21]方法，并略有改進：以沒食子酸作標準曲線，總酚含量換算為每100 g新鮮樣品中沒食子酸當量值(mg/100 g)。總黃酮含量測定參考文獻[22]方法：以蘆丁標準品制作標準曲線，總黃酮含量換算為每100 g新鮮樣品中蘆丁當量值(mg/100 g)；花青素含量的測定參照文獻[23]方法。

1.3.2.4 揮發性物質測定

采用SPME- GC/MS法測定藍莓果酒的揮發性物質。取3 g待測樣品，裝入15 mL樣品瓶，加0.9 g氯化鈉和轉子，密封后50 ℃、400 r/min條件下平衡20 min，75 μm CAR/PDMS萃取頭進行萃取，50 ℃萃取30 min后，GC進樣口解析3 min，同時啟動儀器采集數據。

色譜柱：SPB- 50毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。升溫程序：初溫50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升溫至150 ℃，再以5 ℃/min的速度升溫至250 ℃保持5 min。載氣(He)流速為1.0 mL/min，不分流進樣。質譜條件：接口溫度為250 ℃，離子源溫度220 ℃，電離方式EI，電子能量70 eV，掃描質量范圍為50～600 u。利用質譜與保留指數兩者結合定性，采用TIC峰面積歸一化法對果酒中揮發性物質進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 野生型及突變體菌株釀造的藍莓果酒品質指標比較

圖1 不同釀酒酵母發酵的藍莓果酒的品質變化Fig.1 Change of quality in blueberry wine fermented by different Saccharomyces cerevisiae

接種不同釀酒酵母的藍莓果酒發酵過程中pH值、酒精度、總糖、總酸的變化情況見圖1。野生型釀酒酵母以及4株PDEs基因缺失菌株發酵的藍莓果酒在發酵過程中總糖、酒精度、總酸、pH值的變化趨勢基本一致。由圖1(d)可知，Δpde1/Δpde1菌株利用糖的效率最高，而PDE1/Δpde1菌株利用糖的效率最低。Δpde1/Δpde1菌株在發酵前6 d酒精度增加速度最快，PDE1/Δpde1菌株增加速度最慢，與利用糖的效率呈正相關。Δpde2/Δpde2菌株發酵結束后總酸度最高，為7.18 g/L，是野生型的1.2倍。實驗結果表明，與野生型釀酒酵母相比，PDE1/Δpde1菌株降低藍莓果酒的發酵速度，而Δpde1/Δpde1、Δpde2/Δpde2和PDE2/Δpde2菌株均會提高藍莓果酒發酵速度，其中Δpde1/Δpde1菌株的發酵速度最快。

2.2 野生型及突變體菌株釀造的藍莓果酒的抗氧化能力比較

不同小寫字母代表不同菌株發酵的藍莓果酒的抗氧化能力之間差異顯著。圖2 不同釀酒酵母發酵的藍莓果酒抗氧化指標的變化Fig.2 Changes of antioxidant index in blueberry wine fermented by different strains of Saccharomyces cerevisiae

比較不同酵母菌株發酵的藍莓果酒的抗氧化能力差異，結果見圖2。由圖2(a)可知，野生型發酵的藍莓果酒對DPPH自由基的清除能力為942.76 U/g，PDE1/Δpde1、Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2菌株發酵的果酒清除能力分別是野生型的55%、42%、51%和31%；同時，圖2(b)結果顯示，野生型酵母發酵的藍莓果酒ABTS自由基清除能力為2 387.92 mg/100 g，PDE1/Δpde1和PDE2/Δpde2發酵的果酒ABTS自由基清除能力與野生型能力接近，而Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2菌株的能力分別是野生型的76%和67%；此外，野生型酵母發酵的藍莓果酒羥自由基清除能力為141.72 U/g，Δpde1/Δpde1菌株發酵的果酒羥自由基清除能力達到野生型的1.3倍，而PDE1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2發酵的果酒羥自由基清除能力僅為野生型的49%、75%和24%。結果表明，與野生型釀酒酵母相比，PDEs基因缺失菌株會降低藍莓果酒對DPPH和ABTS自由基的清除能力，且Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2菌株的清除能力低于PDE1/Δpde1和PDE2/Δpde2的清除能力；Δpde1/Δpde1菌株會提高對羥自由基的清除能力。綜合比較，Δpde1/Δpde1菌株的抗氧化能力強于Δpde2/Δpde2菌株的抗氧化能力。

2.3 野生型及突變體菌株釀造的藍莓果酒中活性物質含量的比較

不同小寫字母代表不同菌株發酵的藍莓果酒中活性物質之間差異顯著。圖3 接種野生型和突變菌株的藍莓發酵醪液中活性物質含量Fig.3 Content of active substances of fermented mash with wild and mutant strains

比較接種不同釀酒酵母的藍莓果酒中總酚、總黃酮和花青素含量的差異，結果見圖3。PDEs基因缺失菌株發酵的藍莓果酒的總酚與總黃酮含量與野生型相比差異顯著。野生型釀酒酵母發酵的藍莓果酒總酚質量比為3.24 mg/100 g，Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2菌株發酵的藍莓果酒總酚含量分別為野生型的1.5，1.3和1.15倍，而PDE1/Δpde1菌株發酵的藍莓果酒中總酚含量低于野生型。同時，野生型發酵的藍莓果酒的總黃酮質量比為20.53 mg/100 g，4株突變體發酵的藍莓果酒中總黃酮含量均低于野生型，依次是野生型的63%、65%、69%和18%。相比而言，Δpde2/Δpde2菌株發酵的藍莓果酒中花青素含量是野生型的1.03，PDE1/Δpde1菌株發酵的藍莓果酒中花青素含量與野生型菌株無顯著性差異，Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2菌株發酵的果酒中花青素含量低于野生菌株，依次是野型菌株的92%和90%。結果表明，與野生型釀酒酵母相比，Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2菌株會提高藍莓果酒的總酚含量；PDEs基因缺失會降低藍莓果酒中總黃酮含量，且Δpde2/Δpde2菌株釀造的藍莓果酒中總黃酮含量最低；PDEs基因缺失對藍莓果酒中花青素含量影響較小。

2.4 藍莓果酒抗氧化能力與活性物質的相關性分析

對藍莓果酒的抗氧化能力與活性物質含量進行相關性分析，結果見表1。由表1可知，藍莓果酒的抗氧化能力與總黃酮含量呈正相關，其中ABTS自由基清除能力與總黃酮含量的正相關性達到顯著水平；相比而言，羥自由基清除能力與總酚含量呈正相關，但不顯著，而DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力均與總酚含量呈負相關；DPPH自由基清除能力與花青素含量呈正相關，而ABTS自由基清除能力和羥自由基清除能力與花青素含量呈負相關。分析結果表明，總黃酮可能是藍莓果酒抗氧化能力的關鍵活性物質，而且也可能存在其他活性物質對藍莓果酒的抗氧化能力起重要作用。

表1 果酒抗氧化能力與活性物質的相關性分析Tab.1 Correlation analysis between antioxidant capacity and active components of blueberry wine

2.5 野生型和突變菌株釀造的藍莓果酒揮發性物質比較

從5種不同菌株發酵的藍莓果酒中共檢測到33種揮發性物質，實驗結果見表2。表2中，包括10種醇類物質、11種酯類物質、4種酸類物質、3種酚類物質、3種醛類物質、1種酮類物質和1種烴類物質。圖4為不同釀酒酵母發酵的藍莓果酒中揮發性物質含量，PDE1/Δpde1菌株發酵的果酒中醛類物質為主要成分，其次是醇類物質；而其他4種菌株發酵的藍莓果酒中醇類物質含量最高，Δpde1/Δpde1菌株發酵的果酒中醇類物質高達83%，其次為酸類物質。

表2 野生型和突變菌株釀造的藍莓果酒揮發性物質的種類和含量Tab.2 Species and contents of volatile substances of blueberry wine fermented by wild type and mutant strains

“—”表示未檢測到該物質。

圖4 5種菌株發酵的藍莓果酒中揮發性物質含量Fig.4 Volatile components in blueberry wine fermented by five strains

醇類物質是產生果酒香氣的主要成分，目前在5種藍莓果酒中檢測到的醇類物質主要有芳樟醇、苯乙醇、松油醇(表2)。研究表明，苯乙醇和香葉醇具有玫瑰花香，苯乙醇可在發酵期間產生。芳樟醇、松油醇和香茅醇能增加果酒的果香和甜香的特征[24]。PDE1/Δpde1釀造的藍莓果酒中的醇類物質低于野生菌株，PDE2/Δpde2菌株發酵的藍莓果酒的醇類物質高于野生菌株。Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2菌株發酵的藍莓果酒中的苯乙醇含量明顯高于其他菌株。在突變菌株發酵的藍莓果酒中未檢測到桉樹醇和香茅醇。從醇類物質的變化情況可以看出，Δpde1/Δpde1菌株發酵的藍莓果酒醇類物質含量最高。

酯類物質是果實發酵過程中醇類物質和酸類物質發生酯化反應形成的，也是果酒香氣的主體成分[25]。突變菌株釀造的果酒中酯類物質含量低于野生菌株，尤其PDE1/Δpde1釀造的藍莓果酒只存在肉豆蔻酸異丙酯(表2)。在突變菌株中，Δpde1/Δpde1菌株發酵的藍莓果酒醇類物質含量最高，其次為Δpde2/Δpde2。苯甲酸乙酯、苯乙醇乙酸酯、癸酸乙酯、乙酸丁香酚酯具有果香和花香的特征。Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2菌株發酵過程中產生了乙酸丁香酚酯并增加了苯乙醇乙酸酯的合成。

檢測得到的酸類物質中，辛酸占總酸類物質的60%～90%。突變菌株發酵的果酒中酸類物質總含量明顯低于野生菌株，其中Δpde1/Δpde1菌株發酵的藍莓果酒中酸類物質含量最少。酚類物質主要是愈創木酚、丁香酚和異丁香酚，其中愈創木酚含量最高。愈創木酚具有獨特的芬香氣味，丁香酚和異丁香酚均具有濃烈的丁香香氣和辛香香氣。除了PDE2/Δpde2菌株，其余3株突變菌株發酵的藍莓果酒中愈創木酚含量低于野生菌株。Δpde1/Δpde1菌株發酵過程中產生了異丁香酚。

醛類物質主要檢測到壬醛、苯乙醛和5-羥甲基糠醛。苯乙醛具有水果的甜香氣味，突變菌株發酵的藍莓果酒中苯乙醛的含量低于野生菌株，在突變菌株中，Δpde2/Δpde2菌株釀造的藍莓果酒中的苯乙醛含量最高。4種突變菌株發酵過程產生5-羥甲基糠醛，其中PDE1/Δpde1釀造的藍莓果酒中含量最高。

3 討 論

本研究結果表明，與野生型釀酒酵母相比，突變菌株Δpde1/Δpde1、Δpde2/Δpde2和PDE2/Δpde2均會提高藍莓果酒發酵速度，其中Δpde1/Δpde1菌株在發酵過程中糖的消耗速度以及酒精度的上升速度最快，最能有效提高藍莓果酒發酵速度。研究表明，PDE1對控制葡萄糖和細胞內酸化反應起著重要的生理作用，且敲除PDE1會導致釀酒酵母在添加葡萄糖后cAMP積聚更高[26]，由此可以說明，敲除PDE1基因的釀酒酵母細胞內cAMP水平會升高，信號傳導速度更快，從而利用糖的速度更快。

Δpde1/Δpde1菌株發酵的藍莓果酒的羥自由基清除能力高于野生型菌株，Δpde2/Δpde2菌株發酵的藍莓果酒對DPPH、ABTS和羥自由基清除能力與其他菌株相比均最弱，而且Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2菌株發酵的藍莓果酒對DPPH和ABTS自由基清除能力分別低于PDE1/Δpde1和PDE2/Δpde2菌株的能力。可以推斷，PDEs基因的缺失會降低釀酒酵母發酵藍莓果酒的抗氧化能力，且PDE2基因影響大于PDE1基因，PDEs基因雙敲的影響大于PDEs基因單敲。有研究指出，PDE2缺失會影響許多不同功能類別的基因，也會明顯影響細胞壁的完整性[26-27]。同時，酵母細胞在以葡萄糖為碳源時，其時序壽命與Ras- cAMP信號通路的活性呈負相關[28]，因此，當PDEs基因被敲除后，細胞內信號通路活性增強，而細胞的時序壽命縮短，生成的活性物質會相應減少，從而抗氧化能力下降。又因為PDE1對cAMP親和力和特異性低于PDE2，且有報道稱釀酒酵母細胞內單獨破壞PDE1基因觀察不到PDE2基因被破壞時的一些表型[11]，進一步說明PDE2基因影響大于PDE1基因。

Δpde1/Δpde1菌株釀造的藍莓果酒中總酚含量最高，PDEs基因缺失會降低藍莓果酒中總黃酮含量，而PDEs基因缺失對藍莓果酒中花青素含量影響較小。綜合比較，Δpde1/Δpde1菌株的活性物質含量最高且抗氧化能力最強。PDEs基因缺失菌株釀造的藍莓果酒香氣成分種類和含量存在差異，突變菌株發酵的藍莓果酒中的醇類、醛類、酮類以及烴類物質高于野生型菌株發酵的果酒，但酯類、酸類和酚類物質低于野生型菌株發酵的果酒。此外，PDEs基因雙敲菌株發酵的果酒中醇類、酯類和酮類等香氣成分高于PDEs基因單敲菌株，其中Δpde1/Δpde1菌株發酵的果酒中香氣種類較多，醇類和酯類物質含量最高。

4 結 論

通過考察野生型與PDEs基因缺失釀酒酵母對藍莓果酒發酵特性及品質的影響，發現突變菌株中Δpde1/Δpde1菌株最能有效提高藍莓果酒的發酵速度，PDE1和PDE2基因的缺失會降低釀酒酵母發酵藍莓果酒的抗氧化能力，且敲除PDE2的釀酒酵母釀造的藍莓果酒的抗氧化能力比敲除PDE1的更弱。PDEs基因雙敲菌株發酵的藍莓果酒中香氣物質種類以及含量高于PDEs基因單敲菌株，其中Δpde1/Δpde1菌株發酵的藍莓果酒中芳樟醇、苯乙醇、松油醇和苯乙醇乙酸酯等香氣成分含量較多。由此可知，釀酒酵母中PDEs基因敲除顯著影響果酒發酵的特性，PDE2基因的敲除影響大于PDE1基因，且PDEs基因雙敲的影響大于PDEs基因單敲。