石斛組6種石斛主要化學成分差異分析

王曉媛，王彥兵，李澤生，李 標，丁 剛，白燕冰,*

(1.廣西大學 農學院，廣西 南寧 530004；2.云南省德宏熱帶農業科學研究所，云南 瑞麗 678600；3.中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室/中國醫學科學院 藥用植物研究所，北京 100193)

石斛(Dendrobium)作為“藥食同源”植物，不僅具有珍貴的藥用價值，還具有較高的食用營養成分[1]。石斛的生物活性成分主要有多糖、石斛堿、酚類、必需氨基酸、倍半萜類、甾體類、芪類和木質素類等[2-5]。多糖是石斛主要活性成分之一，大量研究表明，石斛多糖具有清除自由基，提高抗氧化酶活性和抑制脂質過氧化的能力[6-7]；石斛堿具有消炎止痛、保護神經、抑制腫瘤活性的功效[8-9]；醇溶液性成分中含有豐富的芪類(二苯乙烯類)化合物[10]；氨基酸有一定的生理意義，起到防病保健的作用[11]。石斛在國內外都具有很大的藥用開發價值和廣闊的藥品保健品市場。野生鐵皮石斛市場需求量較大，但目前人工繁育種植仍存在一定的限制。研究開發其他品種的石斛是緩解鐵皮石斛資源稀缺的可行性措施。研究表明，目前實際具有開發價值的石斛并不多，藥用最為廣泛的主要有鐵皮石斛(D.officinale)、金釵石斛(D.nobile)、霍山石斛(D.huoshanense)、鼓槌石斛(D.chrysotoxum)、齒瓣石斛(D.devonianum)等[2,12]，對于其他石斛的研究開發相對較少，不利于石斛的種質資源保護。

本研究擬對石斛屬石斛組(sect.Dendrobium)6種石斛(線性石斛、蜻蜓石斛、杓唇石斛、疊鞘石斛、流蘇石斛、細葉石斛)的多糖、醇溶性成分、石斛堿和17種氨基酸的含量進行測定，旨在了解不同種質石斛的化學成分含量和差異，為各種石斛資源的較好利用和開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

供試石斛均采自云南省德宏熱帶農業科學研究所石斛種質資源圃保存的原生種石斛，詳情見表1。采集時間為2017年3月，采集部位為一年生莖段。石斛鮮條于55 ℃烘箱內烘干，粉碎后過三號篩備用。

表1 石斛樣品來源Tab.1 Source of Dendrobium samples

葡萄糖對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號110833- 200904；石斛堿對照品，北京北納創聯生物技術研究院，批號17012003；苯酚、萘(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸鈉和茚三酮為進口試劑。

1.2 儀器與設備

HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；D- 37520型高速離心機，德國Heraeus公司；ME204型電子分析天平，上海恒勤儀器設備有限公司；G2X- 9240MBE型電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；RETSCH MM400型組織磨樣器，濟南泰和盈科商貿有限公司；TGL20MW型臺式冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；Biochrom30+型全自動氨基酸分析儀，大昌華嘉商業(中國)有限公司；SN251668型生物芯片分析儀，美國伯騰公司；6890N型氣相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1多糖含量測定

參照文獻[2]測定多糖含量。選用紫外分光光度法，在488 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，葡萄糖質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程y=0.030 1x+0.004(r=0.999 9)。根據吸光度及標準曲線計算樣品多糖(以葡萄糖計)含量。

1.3.2醇溶性成分測定

參照文獻[2]測定醇溶性成分含量。以95%乙醇作溶劑，以干燥品計算供試品中醇溶性成分的含量。

1.3.3石斛堿含量測定

參照文獻[2]測定石斛堿含量，參照氣相色譜法測定結果[2,13]。

1.3.4氨基酸含量測定

準確稱取石斛粉末樣品0.2 g(精確到0.000 1)，于10 mL安剖瓶中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸，測定除色氨酸以外的17種氨基酸，參照GB/T 5009.124—2003執行[14]。

1.4 數據處理

每項實驗平行重復測定3次，取平均值，所有數據經Origin 85和SPSS 20.0軟件分析。采用Origin 85進行標準曲線繪制及含量計算；采用SPSS 20.0進行氨基酸主成分分析及各成分相關性分析。

2 結果與分析

2.1 多糖含量分析

對石斛組6種石斛多糖含量的測定結果見表2。不同石斛的多糖含量差異較大(P<0.05)。多糖含量最高的是流蘇石斛，質量分數為26.90%，最低的是蜻蜓石斛，質量分數僅為6.92%，二者相差3.9倍。所有石斛樣品均來自同一產地，說明該批石斛多糖含量的差異主要來自基因型的不同，結果與劉文杰等[15]研究結果一致。多糖是石斛的主要藥性成分，若以多糖含量高低衡量石斛品質的優良，本研究結果表明，流蘇石斛、疊鞘石斛品質較優。

表2 6種石斛的多糖、石斛堿和醇溶性成分的含量Tab.2 Content of polysaccharides,dendrobium alkaloids and alcohol soluble components in six species of Dendrobium %

2.2 醇溶性成分含量分析

對6種石斛的醇溶性成分含量進行了測定(表2)，結果發現，6種石斛的醇溶性成分含量有顯著差異(P<0.05)。醇溶性成分質量分數最高的是線葉石斛，為13.01%，流蘇石斛質量分數最低，為3.82%。其他石斛的醇溶性成分含量差異不大，由高到低依次為杓唇石斛、細葉石斛、蜻蜓石斛、疊鞘石斛。本研究結果中，所有石斛除流蘇石斛外，醇溶性成分質量分數均高于中國藥典(不得少于6.5%)的要求，可作為研究醇溶性成分藥性藥效實驗的優良材料。

2.3 石斛堿含量分析

由表2可知，6種石斛樣品僅檢測到線葉石斛中存在少量石斛堿，質量分數為0.019%，低于中國藥典標準0.40%，其余石斛未檢測到相應峰值。大量研究表明，石斛堿是金釵石斛的特征成分，目前未見其他石斛含較高含量的石斛堿。

2.4 氨基酸含量分析

2.4.1氨基酸成分和含量測定結果

6種石斛的17種氨基酸成分和含量測定結果見表3。由表3可知，氨基酸總量為3.58%～8.09%時，其質量分數由高至低依次是蜻蜓石斛、線葉石斛、流蘇石斛、杓唇石斛、疊鞘石斛、細葉石斛。所有樣品中含量最高的3種氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸，蛋氨酸、胱氨酸和組氨酸含量最低。

進一步分析6種石斛樣品中的必需氨基酸、非必需氨基酸、兒童必需氨基酸、支鏈氨基酸、藥用氨基酸以及它們分別占總氨基酸含量的比率。結果表明(表3)，所有樣品的必需氨基酸質量分數為1.39%～3.10%，必需氨基酸占總氨基酸比率均接近40%。6種石斛除流蘇石斛外，必需氨基酸占非必需氨基酸的比率都超過了60%，其中杓唇石斛的必需氨基酸占非必需氨基酸的比率高達68.02%。根據FAO(聯合國糧農組織)和WHO(世界衛生組織)提出的蛋白質理想模式，即必需氨基酸占總氨基酸含量為40%，占非必需氨基酸含量為60%以上[16]。本研究結果表明，除流蘇石斛外，其他5種石斛均接近理想模式，說明5種石斛含有的蛋白質是一種優良的蛋白營養來源，有較大的開發潛力。充足的兒童氨基酸(His、Arg)[17]能有效促進孩子生長發育，有利于身體健康，6種石斛中兒童氨基酸占總氨基酸比率為9.33%～16.57%。支鏈氨基酸(Val、Ile、Leu)[17]具有提高運動能力、緩解運動性疲勞、減輕肌肉酸痛和增強免疫的優良功效。所有石斛樣品的支鏈氨基酸占總氨基酸比率為11.74%～38.55%，占比超過25%的樣品從高至低依次是疊鞘石斛、細葉石斛和杓唇石斛。另外，所有石斛還具有豐富的藥用氨基酸(Asp、Glu、Gly、Arg、Met、Phe、Ile、Leu和Lys)[17-18]，6種石斛藥用氨基酸占總氨基酸比率均在60%以上。

2.4.2氨基酸主成分分析

將6種石斛中的氨基酸進行主成分分析，17種氨基酸主成分得分系數矩陣及特征值見表4。前5個主成分累計方差貢獻率達到了100%，其中第1主成分方差貢獻率最大，占91.05%，說明第1個主要成分在石斛組石斛氨基酸質量評價中起主導作用，前5個主成分已包含17種氨基酸的全部信息。第1主成分特征值為15.48，累計貢獻率為91.05%，Ser、Tyr、Phe等氨基酸有較高載荷，說明第1成分主要反映了Ser、Tyr、Phe等氨基酸指標的信息；同理，第2主成分特征值為0.93，累計方差貢獻率為96.54%，主要反映了Thr、Lys、Arg等指標的信息；第3主成分特征值為0.37，累計方差貢獻率為98.7%，主要反映了Pro、Ile等指標的信息；第4主成分特征值為0.16，累計方差貢獻率為99.61%，主要反映了Glu、Cys、Met、Leu等指標的信息；第5主成分特征值為0.07，累計方差貢獻率為100%，主要反映了Asp、Gly、Ala、Val、His等指標的信息。即前5個主成分已包含了17種氨基酸的全部信息。

表3 6種石斛的氨基酸含量Tab.3 Content of amino acid in six species of Dendrobium %

n=3；T：氨基酸總量；a：必需氨基酸總量；b：非必需氨基酸總量；c：兒童氨基酸總量；d：支鏈氨基酸總量；e：藥用氨基酸。

根據各氨基酸在不同因子上的載荷，可確定Ser、Tyr、Phe 3種氨基酸為石斛組石斛的特征氨基酸。

2.5 4種化學成分含量相關性分析

4種化學成分含量相關性分析見表5。石斛中不同的化學成分在含量上存在一定的相關性：多糖含量與醇溶性成分、氨基酸總量之間呈負相關；醇溶性成分與氨基酸相互之間呈正相關。

3 討論與結論

本研究發現，石斛屬石斛組的6種石斛含有豐富的多糖、醇溶性成分和氨基酸，且差異顯著(P<0.05)。供試石斛來自同一產地，化學成分含量差異主要取決于基因型影響，這與文獻[11]中的研究結論一致。流蘇石斛多糖質量分數為26.90%，高于中國藥典規定(25%)，其在傳統醫學中是中藥石斛的來源之一，深入研究其化學成分和藥理活性具有重要意義。這一結果表明，種植地的環境條件、栽培模式比較適宜該種質流蘇石斛的多糖積累。6種石斛除流蘇石斛外，醇溶性成分質量分數都超過藥典標準6.5%，豐富的醇溶性成分含量為進一步分析其中單一成分提供數據支持。6種石斛中僅線葉石斛檢出石斛堿，且含量極低，未達到2015年版中國藥典標準。6種石斛的氨基酸種類齊全，均含有被檢測的17種氨基酸，除流蘇石斛外，其他5種石斛均接近FAO/WHO提出的理想模式。兒童氨基酸(占氨基酸總量的9.33%～16.57%)、支鏈氨基酸(占氨基酸總量的11.74%～38.55%)及藥用氨基酸(占氨基酸總量的62.41%～67.74%)等功能性氨基酸含量較為豐富。分析結果表明，6種石斛具有較高的藥用價值和營養價值。6種石斛氨基酸主成分分析表明，前5個主成分已包含17種氨基酸的全部信息，可作為功能氨基酸的描述性指標。主成分分析確定的Ser、Tyr、Phe 3種氨基酸為石斛組石斛特征氨基酸，可為進一步建立石斛組石斛化學成分分類方法及深入研究和開發石斛組石斛提供參考依據。

表4 17種氨基酸主成分得分系數矩陣及特征值分析Tab.4 Score coefficient matrix and eigenvalue analysis of 17 amino acids

表5 6種石斛中不同化學成分的相關分析Tab.5 Correlation analysis of different chemical components in six species of Dendrobium

從植物學的角度分類，6種石斛都屬于石斛屬石斛組，然而該分類方式無法體現石斛中主要化學成分的差異性，不利于針對性地進行成分分析。化學成分相關性分析表明，多糖含量與醇溶性成分、氨基酸總量之間呈負相關；醇溶性成分與氨基酸之間呈正相關，該分析結果與燈籠組石斛[19]有一定差異性，說明各類群之間存在一定差異性，應分別加以研究。石斛組6種石斛化學成分差異顯著，僅從外觀形態對石斛進行分組存在一定局限性，其分類有待進一步研究和探討。不同化學成分表明其藥理作用不同，應分別進行研究，以便科學高效地開展石斛優良品種選育。