宣威火腿中抗菌肽的分離、純化及鑒定

邢路娟，曹松敏，鄭錦曉，周光宏，張萬剛

(南京農業大學 食品科技學院/肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095)

抗菌肽是一類對抗外源性病原體的小分子肽類物質，結構一般由10～50個氨基酸組成。天然抗菌肽具有安全性高、耐藥性強、來源廣泛等優點[1]，因而逐步成為開發新型抗菌劑的研究方向。截至2019年，已有8 000多種抗菌肽被鑒定發現，其中約有2 000多種抗菌肽從天然產物中提取得到[2]。目前，已發現的抗菌肽來源以魚類、昆蟲類抗菌肽居多，而抗菌肽在肉制品中的研究涉及較少。Stadnik等[3]通過體外抑菌實驗，證實了豬肉和牛肉蛋白中分離得到的功能性肽具有一定的抑菌作用。Castellano等[4]對西班牙干腌火腿粗多肽進行分離并測定其抑制李斯特菌生長的能力，得到了具有較好抑菌能力的肽段RHGYM。

宣威火腿作為中國三大傳統干腌火腿之一，具有豐富的營養價值。在長時間的成熟過程中，宣威火腿中的蛋白質發生內源酶降解反應，進而產生豐富的肽類、氨基酸及含硫化物等成分[5]。研究表明，干腌火腿中存在的多肽具有抗氧化、降血壓、抑菌等活性。Zhu等[6]研究發現金華火腿多肽中的GKFNV起主要抗氧化作用。Xing等[7]在宣威火腿中發現粗多肽具有較高的抗氧化活性，并鑒定出具有較高抗氧化活性的序列DLEE。為了從抑菌活性方面評價干腌火腿中多肽的功能特性，本實驗選取O157型大腸桿菌和單增李斯特菌兩種常見的食品類研究檢測菌種為研究對象，重點探究宣威火腿粗多肽的抑菌能力，并對部分具有較高抑菌活性的多肽進行序列的驗證和鑒定，從而為闡釋火腿多肽在抑菌方面的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宣威火腿，云南省宣威市浦記火腿食品有限公司；O157型大腸桿菌(No.21530)、單增李斯特菌(ATCC19115)(No.21635)，中國微生物菌種保藏管理中心。PI及SYTO-9熒光染料，Sigma公司；鄰苯二甲醛、β-巰基乙醇、硼砂、乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉，國藥集團化學試劑公司；平板計數培養基及結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)等培養基，北京陸橋技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Bioscreen C FP1100- C型全自動細菌生長記錄儀，芬蘭Bioscreen公司；Scan1200型自動影像分析菌落計數器，法國Interscience公司；AKTA Purifier UOC10型蛋白純化系統，瑞典 GE Healthcare公司；ES2030型冷凍干燥機，日本 Hitachi公司；Spectral Max M2e型多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1粗多肽粉的提取

參照王娟等[8]的方法并稍作修改。取成熟火腿股二頭肌25 g，絞碎后放入離心瓶，加入100 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.2)，勻漿(2 2000 r/min)3次，每次10 s。在4 ℃條件下靜置2 h后離心(4 ℃、8 000 r/min)20 min，吸取上清液，加入3倍體積的乙醇(體積分數 40%)，靜置12 h。再次離心(4 ℃、8 000 r/min)20 min。冷凍干燥并于-20 ℃冰箱中冷藏備用。

1.3.2抑菌率測定

參考張順亮等[9]的研究方法，測定粗多肽對O157型大腸桿菌和單增李斯特菌的抑菌活性，以抑菌率表示。將大腸桿菌和李斯特菌培養至對數生長期并用無菌生理鹽水進行稀釋，調整濃度分別為1.0×106、1.0×105CFU/mL。按照體積比1∶4，吸取細菌培養液500 μL與2 mL多肽溶液(0.22 μm濾膜過濾)混合后加入實驗管中，以無菌磷酸鹽緩沖溶液為對照，同時振蕩培養1 h(37 ℃,150 r/min)后對菌液進行梯度稀釋，取100 μL涂布于計數平板上，37 ℃培養24 h，記錄菌落總數。抑菌率計算見式(1)。

抑菌率=(N0-N1)/N0×100%。

(1)

式(1)中：N0為對照管細菌菌落總數，N1為實驗管細菌菌落總數。

1.3.3陰離子交換色譜分離宣威火腿抗菌肽

采用20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH值8.0)平衡HiPrep Q FF 16/10強離子交換柱(1.6 cm×10 cm)，流速2.0 mL/min。將宣威火腿粗多肽溶解在磷酸鹽緩沖溶液(pH值 8.0)中，配制成5.0 mg/mL的溶液，并經過濾膜(0.45 μm)過濾后上樣(2.0 mL)。洗脫液A為磷酸鹽緩沖溶液(20 mmol/L，pH值8.0)；洗脫液B為含1 mol/L NaCl 的磷酸鹽緩沖溶液(20 mmol/L，pH值 8.0)，按濃度梯度洗脫；洗脫流程為0～60 min，0～100%A，100～0%B，流速2.0 mL/min，檢測波長280 nm。分別收集每個洗脫分離出來的峰組分，冷凍干燥后進行抑菌能力測定。

1.3.4尺寸排阻色譜純化宣威火腿抗菌肽

對經陰離子色譜洗脫后獲得的具有較強抑菌活性的組分進行尺寸排阻色譜純化。首先用去離子水平衡凝膠色譜柱(5 cm×60 cm)，柱料填充采用葡聚糖凝膠Sephadex G-25，流速為2.0 mL/min。將待純化組分溶解于去離子水中，配置成5.0 mg/mL的溶液，用0.45 μm的濾膜過濾后進樣，上樣量為2.0 mL。采用超純水作為洗脫液，流速設置為2.0 mL/min，檢測波長為280 nm。多次洗脫，分別收集洗脫后的各個組分，冷凍干燥后進行質譜鑒定。

1.3.5Nano-LC-ESI-MS/MS鑒定肽序列

參考Pinkse等[10]方法，用Nano-LC-ESI-MS/MS液質聯用設備分離并鑒定多肽組成。HPLC條件：Aligent C18色譜柱(75 μm×8 cm，3 μm，300)；流動相A組成為97.5%超純水、2%乙腈、0.5%甲酸；流動相B組成為9.5%超純水、90%乙腈、0.5%甲酸；梯度洗脫條件為0～60 min，98%～10% A，2%～90% B；流速800 nL/min，上樣量3 μL。

ESI-MS/MS質譜條件：HPLC在線與電噴霧質譜(ESI)串聯，即樣品經HPLC洗脫后通過電噴霧離子化方法電離，并直接進入質譜儀。電離電壓范圍1.2～1.8 kV，每次使用需經優化確認；毛細管溫度設定為110 ℃；質譜儀模式選用動態數據依賴模式(data-dependent mode)，通過低能碰撞誘導解離(collision induced dissociation，CID)獲取二級質譜數據。顯微掃描質量范圍為550～1 800 amu；默認碰撞能力為33%；動態排除功能設置為0.3 min內重復計數，排除時間為0.4 min，排除寬度為4 Da。

1.3.6合成抗菌肽的抑菌能力測定

已知氨基酸序列的多肽由蘇州強耀生物科技有限公司合成，隨后進行合成肽抑制大腸桿菌和李斯特菌能力的驗證，實驗方法同1.3.2節。

1.4 數據處理

實驗結果用平均值±標準差表示。方差分析采用SAS 8.0中one-way ANOVA分析，通過Duncan’s multiple-range test比較單個均值之間的差異性(P<0.05)，實驗重復6次。

2 結果與討論

2.1 宣威火腿粗多肽的抑菌活性分析

使用宣威火腿粗多肽進行O157型大腸桿菌和單增李斯特菌的生長抑制實驗，結果如圖1。宣威火腿多肽對O157型大腸桿菌和單增李斯特菌的抑制能力隨著多肽質量濃度的增加而增強。在4.0 mg/mL的質量濃度下，宣威火腿多肽對O157型大腸桿菌的抑制作用達到96%；對單增李斯特菌的抑菌實驗中，當質量濃度為4.0 mg/mL時，抑制效果僅為53%。單增李斯特菌是典型的革蘭氏陽性菌，其細胞壁較大腸桿菌厚，抗菌肽很難破壞；而O157型大腸桿菌的肽聚糖層較薄，抗菌肽較易改變其通透性，從而賦予火腿粗多肽抑制細菌生長的能力。

不同小寫字母表示同一菌種的抑菌率在不同質量濃度時差異顯著(P<0.05)。圖1 宣威火腿粗多肽對O157型大腸桿菌和單增李斯特菌的抑制作用Fig.1 Effect of Xuanwei ham peptides on inhibition of E.Coli O157 and L.monocytogenes

2.2 宣威火腿粗多肽提取物離子交換色譜分離分析

根據帶電荷種類、數量及分布的不同，離子交換色譜可以將混合組分進行逐級分離，其主要特點是填料中的帶電荷樹脂可以與樣品中的帶電離子進行可逆交換，從而實現不同電荷樣品的逐級分離[11]。本研究采用了HiPrep Q FF 16/10強陰離子交換色譜，當流動相按離子強度由弱到強洗脫時，由于不能與固定相結合，因此凈電荷為負或中性的組分最先被洗脫出來，隨后各組分按所帶正電荷由弱到強的順序依次被洗脫出來。宣威火腿粗多肽提取物經離子交換色譜分離得到7個組分(見圖2)。收集各組分并分別使用0.5、1.0 mg/mL的質量濃度測定其對大腸桿菌及單增李斯特菌的抑制能力(見圖3)。經離子交換色譜分離得到的7個組分中的組分1和組分2未檢測出對兩菌種的抑制活性，而組分3～7對O157型大腸桿菌和單增李斯特菌的抑制活性呈現一定差異，其中組分7具有較高的抑菌活性，對大腸桿菌和李斯特菌的抑菌率分別為98%和56%，顯著高于其他組分(P<0.05)。組分3～5對大腸桿菌的抑制活性沒有顯著差異(P>0.05)，且抑制率均在70%以上；而對于單增李斯特菌的抑制活性差異顯著,其中組分4和6的活性均在40%左右，顯著高于組分3和5(P<0.05)。由于各組分是通過電荷差異分離的，可知宣威火腿中的抗菌肽活性與其所帶的電荷種類及強弱存在一定的關系[12]，最后洗脫得到的組分帶正電荷、極性最強，是典型的陽離子肽，且抑菌活性最強。其他組分抑菌率較低，可知凈電荷為負且電荷強度較弱的組分抑菌能力也較弱。由于組分7抑菌活性最強，因而進行重復收集，從而進行下一步凝膠層析純化。

1～7為分離得到的多肽組分。圖2 宣威火腿粗多肽提取物的離子交換色譜Fig.2 Ion exchange chromatography of peptides extracted from Xuanwei ham

ρ(大腸桿菌)=0.5 mg/mL，ρ(李斯特菌)=1.0 mg/mL；不同小寫字母表示同一菌種的抑菌率在不同質量濃度時差異顯著(P<0.05)。圖3 離子交換色譜分離得到各組分對O157型大腸桿菌和單增李斯特菌的抑菌能力Fig.3 Effect of fractions isolated by ion exchange chromatography on inhibition of E.coli O157 and L.monocytogenes

2.3 宣威火腿粗多肽提取物尺寸排阻色譜純化分析

尺寸排阻色譜又稱分子篩凝膠層析，洗脫原理是根據樣品中各組分的分子質量大小進行逐級分離[13]。在流動相選擇方面，凝膠層析通常使用超純水作為流動相來進行洗脫，避免混入新的鹽物質。本實驗使用的是G-25的葡聚糖凝膠柱，可分離小分子蛋白質及多肽類物質[14]。將離子交換色譜收集得到的組分7進行G-25凝膠色譜分析，見圖4。由圖4可知，組分7經過尺寸排阻色譜洗脫后只得到一個主要峰，說明該成分中的多肽具有相近的分子質量。從電導率曲線變化可知，組分7中的多肽與鹽分完全分離，從而起到純化多肽及脫鹽的效果。

圖4 宣威火腿粗多肽提取物組分7的尺寸排阻色譜Fig.4 Size exclusion chromatography of 7th fraction extracted from Xuanwei ham

2.4 Nano-LC-ESI-MS/MS肽序列鑒定分析

抗菌肽的分子結構與分子質量大小是影響其自身抑菌活性的最重要因素?？咕牡姆肿淤|量大多分布于1 000～4 000 Da之間，其較長的肽鏈可形成特定的二級結構，從而有助于抑菌功能的發揮[15]。Wang 等[16]對525種抗菌肽分析發現，97%的抗菌肽由少于50個的氨基酸殘基組成，平均長度為18個氨基酸殘基，部分抗菌活性較高的多肽序列少于3個氨基酸。從林蛙中分離提純的抗菌肽(BLPs)由25～27個氨基酸組成，具有較強的疏水性[17]。Ponti等[18]研究蛙屬中的抗菌肽，并從中鑒定出由24～34個氨基酸組成的活性成分。周義文等[19]研究發現純化后的家蠅抗菌肽對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌具有較好的抑制作用，用Nano-ESI-Q-TOF2-MS/MS測定氨基酸序列，得到2條抗菌肽的氨基酸序列為YDLLNVDEEVRFR和YDNVNLDELLNSDR。為了進一步確定宣威火腿中抗菌肽的組成，本實驗選取質譜鑒定手段，將純化得到的多肽進行氨基酸測序分析(見表1)。組分7經過質譜鑒定后得到了QYYNGEEHVRFDSDVGEYR、LRNLPNLEVLDLGTNFI、FASFEAQGALANIAVDK多肽序列。肽段的分子質量均在2 500 Da以下，二級質譜見圖5至圖7。

圖5 肽段QYYNGEEHVRFDSDVGEYR的二級質譜Fig.5 MS/MS spectrum of peptide fraction QKKNGEEHVRFDSDVGEYR

圖6 肽段LRNLPNLEVLDLGTNFI的二級質譜Fig.6 MS/MS spectrum of peptide fraction LRNLPNLEVLDLGTNFI

圖7 肽段FASFEAQGALANIAVDK的二級質譜Fig.7 MS/MS spectrum of peptide fraction FASFEAQGALANIAVDK

表1 組分7的肽序列液相色譜- 質譜聯用鑒定結果Tab.1 Peptide sequences identification of 7th fraction by LC-MS/MS

2.5 合成肽的抗菌活性驗證

表2列出了3條合成抗菌肽抑制大腸桿菌和李斯特菌的情況。3條合成抗菌肽均具有較好的抑菌能力，對O157型大腸桿菌的抑菌率達90%以上，且沒有顯著差異(P>0.05)。在抑制單增李斯特菌的能力上，3條合成抗菌肽中QYYNGEEHVRFDSDVGEYR的抑菌率超過50%，顯著高于其他2條肽段(P<0.05)。根據抗菌肽的構效關系可知，在一級結構的基礎上，抗菌肽一般富含Lys、Arg、Trp和Gly等特定氨基酸，疏水性氨基酸同樣對抑菌活性有影響[20]。對比本實驗得到的3條肽段可知，QYYNGEEHVRFDSDVGEYR比其他2條肽段含有更多的Lys、Arg、Trp和Gly，這也可能是引起抑制李斯特菌能力顯著高于其他2條肽段的原因。

表2 合成肽的抗菌活性測定結果Tab.2 Antibacterial activity of synthetic peptides

不同小寫字母表示同列數據之間差異顯著(P<0.05)。

3 結 論

研究通過離子交換色譜、尺寸排阻色譜對宣威火腿粗多肽提取物按照所帶電荷特征不同、分子質量大小不同進行分離，分離得到的各個組分又具有不同的抑菌活性，其中組分7活性最強，對大腸桿菌和李斯特菌的抑菌率分別為98%和56%。經過Nano-LC-ESI-MS/MS肽序列鑒定，得到活性最強的3條陽離子肽。通過合成并驗證其活性，可知QYYNGEEHVRFDSDVGEYR、LRNLPNLEVLDLGTNFI、FASFEAQGALANIAVDK均具有較強的抑制O157型大腸桿菌和單增李斯特菌的能力，且抑制O157型大腸桿菌的能力優于單增李斯特菌。以上研究說明在宣威火腿中存在具有抗菌活性的多肽，且經過逐步分離得到了具有已知序列的多肽成分，進一步證實了干腌火腿多肽的功能性，從而為開發抗菌肽及其相關研究奠定了基礎。