葉雅芳，劉德星，李婷婷，邱德義，劉環宇

蠓科(Ceratopogonidae)是雙翅目(Diptera)中種類繁多、分布甚廣的體型較小的昆蟲，部分刺吸人畜血液的種類被稱為吸血蠓，其中庫蠓屬(Culicoides)是分布最廣、種類最多、與人畜關系最密切的吸血蠓之一。庫蠓全世界分布，約有1 400多種，在我國分布有347種[ 1-2]。庫蠓不但刺吸人畜血液引起蟲咬性皮炎和皮膚過敏性癥狀，而且還是奧柔普西病毒病(Oropouche virus，OROV)、藍舌病毒(Bluetongue virus, BTV)、施馬倫貝格病毒(Schmallenberg virus, SBV)、等多種人畜病原體的傳播媒介[3]。家畜流行病對畜牧業影響巨大，歐洲BTV和SBV的大暴發曾造成巨大的經濟損失[4-5]。了解庫蠓的種類、分布、吸血特性及病原體攜帶率是有效預防控制疫病流行和傳播的關鍵，因此庫蠓的準確鑒定對于蠓傳疾病的研究和防控有著重要的意義。

由于雌蠓才具吸血習性，對疾病的傳播具有重要意義，因此雌蠓的分類鑒定尤其重要，但傳統形態學鑒定方法是根據成蟲外部形態特征以及雄蟲的尾器才能進行有效鑒定，而雌蟲、幼蟲或肢體殘缺的蟲體難以辯認，且蠓類中有效的形態鑒定特征極少，對近似種的分類鑒定十分困難，從而影響庫蠓地理分布及其傳播疾病的深入研究[6-7]。近年來，隨著研究人員對線粒體DNA的深度挖掘和廣泛應用，線粒體DNA已成為昆蟲物種分類和分子序列分析的一種有效分子標記，如線粒體COI基因和Cytb基因片段[8-12]。

中山市位于東經113°9′2″至113°46′，北緯22°11′12″至22°46′35″，位于珠江三角洲中部偏南的西、北江下游出海處，處于北回歸線以南，熱帶北緣，光照充足，熱量豐富，氣候溫暖，冬季氣候變化緩和，地理條件和氣候條件均適合蠓類生長，且目前尚未見到學者系統開展中山市庫蠓的調查研究。本研究以臺灣蠛蠓Lasioheleataiwana、叢林鋏蠓Forcipomyiabessa、美島裸蠓Atrichopogonformosanus、彎曲阿蠓Alluaudomyiaflexuosa為外群，對2018年4月至2019年3月在中山市不同生境采集的庫蠓進行系統的形態學鑒定以及COI基因和Cytb基因序列分析，為研究我國庫蠓快速、準確的分類鑒定提供資料，也為進一步研究其種群分布、種群遺傳結構及其傳播相關疾病的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1庫蠓標本 本研究所用的104只庫蠓(13只雄蟲，91只雌蟲)為2018年4月至2019年3月采集于中山市不同生境(詳細信息見表1)。

表1 12種庫蠓的詳細信息

Tab.1 Information ofCulicoidesin this study

種名拉丁學名雄♂雌♀采集地GenBank序列號COICytb原野庫蠓Culicoides homotomus1♀6MK917544MK917648蘇島庫蠓Culicoides sumatrae1♀5MK917542MK917646異域庫蠓Culicoides peregrinus1♀4MK917543MK917647琉球庫蠓Culicoides actoni3♀4MK917539-917539MK917608-917610殘肢庫蠓Culicoides imicola2♀5MK896861,917442MK917545,917546連斑庫蠓Culicoides jacobsoni1♀4MK917538MK917607撫須庫蠓Culicoides palpifer1♂14♀4,5,7MK917477-917491MK917547-917561荒川庫蠓Culicoides arakawai9♂8♀1,3,6,7MK917494-917509MK917564-917580環斑庫蠓Culicoides circumscriptus1♂1♀2MK917492-917493MK917562,917563尖喙庫蠓Culicoides oxystoma10♀4MK917527-917537MK917597-917606霍飛庫蠓Culicoides huffi2♂14♀2,4,6,7MK917511-917527MK917581-917596似同庫蠓Culicoides similis35♀5,4,7MK917443-917477MK917622-917645

注：采集地1：居民區(康逸豪園)2：辦公區(中山海關中山六路院內)3：城中村(三溪村)4：市內公園(紫馬嶺公園)5：城郊農莊(一魚六味飯店，有家禽舍)6：林區(大尖山農戶雞舍)7：城郊大學校園(獅頭山)

1.1.2主要試劑 血液和組織DNA提取試劑盒(編號：Q5523)購自天根生化科技有限公司，dNTP、rTaq DNA聚合酶等購于大連寶生物有限公司，引物由Invitrogen公司合成。引物序列：

COI基因擴增引物：

LCO1490(5′-GGTCAACAAAATCATAAA-GATATTGG-3′)；

HCO2198(5′-TGATTTTTTGGTCACCCTGGAAGTTTTA-3′)[13]

Cytb基因擴增引物：

Cytb424-449(5′-GCRTAWGCRAAWARRA-ARTAYCAYTCWGG-3′)；

Cytb876-847(5′-ATYTGWCCYCAWGGWA-RWACRTAWCC-3′)[14]

1.2 方 法

1.2.1庫蠓采集 根據庫蠓的生活習性，選擇燈誘法(功夫小帥，24 W，12V，波長365 nm，武漢市吉星環保科技有限責任公司)。在7種不同的生態環境中居民區(康逸豪園)、辦公區(中山海關中山六路院內)、城中村(三溪村)、市內公園(紫馬嶺公園)、城郊農莊(一魚六味飯店，有家禽舍)、林區(大尖山農戶雞舍)、城郊大學校園(獅頭山)布置采樣點進行蠓蟲收集，每月的上下旬各采集一次。在所選的生境內，選擇遠離光源干擾和避風的室外場所作為掛燈點，每個采樣點掛誘蟲燈3盞，光源離地1.5 m，于日落前1 h接通電源，連續燈誘3 h后取出集蠓袋，做好標記，蠓連同集蠓袋放置于-20℃冰箱冷凍致死。

1.2.2庫蠓基因組DNA提取 參照文獻的方法[15]，挑選形態完整的庫蠓，切下翅置于玻片上，把剩余部分浸泡在220 μL含有1%蛋白酶K的組織消化緩沖液(天根公司DNA提取試劑盒)中，56 ℃消化過夜，按試劑盒操作說明從消化液中提取庫蠓基因組DNA，提取的DNA置于4 ℃暫存備用。

1.2.3樣本處理和形態學鑒定 對消化后的庫蠓進行清洗、逐步脫水、切下頭部和腹部、將頭部的觸須、觸角，腹部、足擺正后，滴上加拿大樹膠(加丁香油)，重新調整擺正，封片，最后制成玻片標本[16]。待研究庫蠓根據外部形態特征按照《中國蠓科昆蟲》[2]，顯微鏡鏡檢鑒定種類，取一側翅進行拍照。

1.2.4PCR的擴增 分別采用COI基因和Cytb基因通用引物[13-14]進行 PCR 擴增。PCR擴增體系如下：DNA模板3 μL，上、下游引物(10 μL/L)各1 μL/L，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 2 μL，rTaq酶0.5 μL，加ddH2O補至50 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環，最后再72 ℃延伸10 min。

1.2.5序列測定及分析 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增情況，并將擴增產物送至上海立菲公司雙向測序，測序引物同擴增引物。使用DNAMAN軟件，將去除兩端引物后的正向序列在GenBank數據庫進行比對鑒定物種。

1.2.6COI和Cytb序列分析 將庫蠓104條COI序列和Cytb序列上傳至GenBank，每條序列及其憑證標本詳細信息見表1，并在GenBank中引入85種庫蠓656條序列長度658 bp以上的COI序列和2種庫蠓234條序列長度300 bp以上的Cytb序列(已剔除未明確到種和同一蠓種的序列差異>2%的序列)，采用自測的臺灣蠛蠓、叢林鋏蠓、美島裸蠓、彎曲阿蠓8條COI序列和8條Cytb序列分別作為外群，使用MEGA6.0軟件將以上所得的COI序列和Cytb序列，截取出完全重合的序列進行分析，基于Kimura2-parameter 模型，鄰接法構建NJ樹(自檢值設置為1 000次)。

2 結 果

2.1主要形態特征描述 根據104只庫蠓頭部、翅、腹部、尾器的形態描述進行檢索鑒定標本，鑒定結果為原野庫蠓(1♀)、蘇島庫蠓(1♀)、異域庫蠓(1♀)、琉球庫蠓(3♀)、殘肢庫蠓(2♀)、連斑庫蠓(1♀)、撫須庫蠓(1♂，14♀)、荒川庫蠓(9♂，8♀)、環斑庫蠓(1♂，1♀)、尖喙庫蠓(10♀)、霍飛庫蠓(2♂，14♀)、似同庫蠓(35♀)12種庫蠓(表2、圖1)。由表2、圖1可知：1)頭部：該12種庫蠓頭部形態特征(復眼是否連接、眼面間柔毛、觸須第3節感覺器窩)之間不完全存在差異，不能作為鑒別特征。2)翅：該12種庫蠓翅特征(翅面淡、暗斑是否明顯、翅臀室淡斑數目、徑中淡斑是否覆蓋第1 徑室基部和徑中橫脈、翅面大毛所在位置、徑5 室淡斑數目、徑5 室淡斑位置)和一側翅圖之間均存在差異，可作為鑒別的特征。3)腹部：庫蠓雌蟲腹部特征(受精囊數目、受精囊形態)之間不完全存在差異，可知庫蠓雌蟲腹部特征不能作為鑒別的特征。4)尾器：該12種庫蠓雄蟲尾器形態(陽莖中葉形態、陽莖中葉側突形態)之間存在很大的差異，因此雄蠓可以根據其尾器形態進行有效鑒定。

圖1 12種庫蠓一側翅圖Fig.1 Wing of Culicoides

2.2 COI序列分析

2.2.1COI序列構成 104只12種庫蠓COI的長度均為658 bp。撫須庫蠓、環斑庫蠓、似同庫蠓、蘇島庫蠓4種庫蠓COI序列在GenBank中未找到相應序列，為本研究首次獲得。從GenBank數據庫中引用85種庫蠓COI序列656條，采用自測的其它蠓屬COI序列有臺灣蠛蠓2條、叢林鋏蠓3條、美島裸蠓2條、彎曲阿蠓1條。將以上所得的COI序列對齊，截取出完全重合的序列后，共獲得93種庫蠓768條長度為612 bpCOI序列。

2.2.2COI序列同源性比對 將本研究所獲12種庫蠓COI序列與GenBank數據庫中的序列進行同源比對，原野庫蠓、異域庫蠓、琉球庫蠓、殘肢庫蠓、連斑庫蠓、荒川庫蠓、尖喙庫蠓、霍飛庫蠓的COI序列相似度皆大于98%，說明該8種庫蠓的形態鑒定結果與GenBank數據庫中的COI基因序列比對結果一致。撫須庫蠓、蘇島庫蠓在GenBank中均未收錄COI序列，而似同庫蠓、環斑庫蠓與GenBank數據庫中的COI序列相似度小于98%。

2.2.3COI聚類分析 基于COI聚類分析表明(圖2)，不同種類蠓間無交叉，且相同種類蠓的不同個體均聚在同一分支下，支持率達到99%以上，僅Bakhoum鑒定的似同庫蠓[17]雖聚在同一分支但支持度僅90%。庫蠓屬與蠛蠓屬、鋏蠓屬、裸蠓屬、阿蠓屬混在不同支序內，但因支持度低(<20%)，無法說明其親緣關系，符合關于COI基因不適合進行系統進化關系分析的結論[18]，對上述4屬并入庫蠓屬的現象，在其他昆蟲中也有類似的結果[19]。蘇島庫蠓與其近似種無害庫蠓序列相似度95.24%，低于98%，該兩庫蠓間無交叉，說明COI基因在不同蠓種間有明顯差異，可以用于鑒定和區分近似蠓種。撫須庫蠓、霍飛庫蠓、荒川庫蠓、環斑庫蠓該4種庫蠓雌蟲與其雄蟲形態特征之間存在差異，而雌蟲COI基因序列與雄蟲序列聚在同一分支下且相似度98%以上，說明同一種的雌雄庫蠓之間COI基因的差異小于種間差異，可以用于雌蟲的種類鑒定。

2.3 Cytb序列分析

2.3.1Cytb序列構成 104只12種庫蠓Cytb的長度均為394 bp。原野庫蠓、蘇島庫蠓、異域庫蠓、琉球庫蠓、殘肢庫蠓、連斑庫蠓、撫須庫蠓、荒川庫蠓、環斑庫蠓、尖喙庫蠓、霍飛庫蠓、似同庫蠓10種庫蠓Cytb序列在GenBank中未找到相應序列，為本研究首次獲得。從GenBank中引用2種庫蠓荒川庫蠓、殘肢庫蠓Cytb序列248條。采用自測的其它蠓屬Cytb序列有臺灣蠛蠓2條、叢林鋏蠓3條、美島裸蠓2條、彎曲阿蠓1條。將以上所得的Cytb序列對齊，截取出完全重合的序列后，共獲得16種庫蠓360條長度321 bpCytb序列用于分析。

2.3.2Cytb序列同源性比對 將本研究12種庫蠓的全部Cytb序列與GenBank數據庫中的序列進行同源比對，荒川庫蠓、殘肢庫蠓Cytb序列相似度皆大于98%，說明該2種庫蠓的形態鑒定結果與GenBank數據庫中的Cytb基因序列比對結果一致。其余10種庫蠓原野庫蠓、蘇島庫蠓、異域庫蠓、琉球庫蠓、殘肢庫蠓、連斑庫蠓、撫須庫蠓、荒川庫蠓、環斑庫蠓、尖喙庫蠓、霍飛庫蠓、似同庫蠓在GenBank中均未收錄有Cytb基因序列。

注：♂.雄性庫蠓序列；♀.雌性庫蠓序列；★.GenBank引用的序列。進化樹等邊三角形?的底邊長度代表每個物種含有個體數目的多少圖2 基于COI構建的NJ樹(Kimura 2-parameter模型)Fig.2 Neighbor-jointing tree based on the mitohondrial gene COI sequence

2.3.3Cytb聚類分析 基于Cytb聚類分析表明(圖3)，不同種類蠓間無交叉，且相同種類蠓的不同個體均聚在同一分支下，支持率均達到99%，說明Cytb基因在不同蠓種間有明顯差異，可以用于鑒定和區分蠓種。庫蠓屬與蠛蠓屬、鋏蠓屬、裸蠓屬、阿蠓屬混在不同支序內，但因支持度低(<10%)，無法說明其親緣關系，說明Cytb不適合進行系統進化關系分析，對上述4屬并入庫蠓屬的現象，與本研究COI聚類分析的研究結果一致。撫須庫蠓、霍飛庫蠓、荒川庫蠓、環斑庫蠓雌蟲Cytb基因序列與雄蟲序列聚在同一分支下且相似度98%以上，說明同一種的雌雄庫蠓之間Cytb基因的差異小于種間的差異，可以用于雌蟲的種類鑒定。

注：♂.雄性庫蠓序列；♀.雌性庫蠓序列；★.GenBank引用的序列。進化樹等邊三角形?的底邊長度代表每個物種含有個體數目的多少圖3 基于Cytb構建的NJ樹(Kimura 2-parameter模型)Fig.3 Neighbor-jointing tree based on the mitohondrial gene Cytb sequence

3 討 論

本研究在中山市不同生境采集的撫須庫蠓、霍飛庫蠓、荒川庫蠓、環斑庫蠓雄蟲可以根據其尾器的形態特征進行有效鑒定，而12種庫蠓雌蟲僅可從翅部特征的細微差異進行鑒定和區別，特別是近似種，如蘇島庫蠓與無害庫蠓。線粒體DNA(mtDNA)具有多拷貝、分子量小、母系遺傳、突變速度適中等特點，能準確鑒別物種[22]。目前，已有多個研究表明在對蚤目、同翅目和雙翅目(搖蚊科、麻蠅科)等昆蟲進行序列分析時聯合形態學特征以及線粒體DNA(mtDNA)綜合分析得到的結果比單獨使用線粒體COI基因分析得到的結果更為理想[23-25]。因此，本研究基于形態學特征和COI、Cytb分子標記數據綜合分析對12種庫蠓進行鑒定，驗證了線粒體COI和Cytb基因序列可作為庫蠓的分類鑒定和序列聚類分析的有效分子標記，可得到更為準確的種類鑒定和序列分析結果。

庫蠓雄蟲可以根據其尾器特征進行有效鑒定，而庫蠓雌蟲有效的形態鑒定特征極少，尤其大多近似種僅可從翅特征的細微差異進行鑒定和區別，例如蘇島庫蠓與無害庫蠓是近似種，許多形態特征相似，只能根據翅特征進行鑒別：蘇島庫蠓翅基淡斑大，向后延伸至臀室基部翅緣，即翅基淡斑與臀室基部淡斑融合，臀室只有2個淡斑；而無害庫蠓翅基淡斑與臀室基部淡斑分離，臀室均有3個淡斑，其余形態特征幾乎無異[15]，但該2種庫蠓COI序列相似度95.24%，低于98%，說明COI基因在近似蠓種間有明顯差異，這與COI基因用于其它昆蟲近似種的研究結果相似[26-28]，可以用于鑒定和區分近似蠓種，所以該12種庫蠓形態學鑒定的結果需要分子鑒定加以補充。本研究組的似同庫蠓形態特征與《中國蠓科昆蟲》[2]的似同庫蠓相一致，而Bakhoum鑒定的似同庫蠓[17]與本研究的似同庫蠓翅特征不一致，COI序列相似度為88.18%，低于98%；Harrup鑒定的似同庫蠓[20]與本研究的似同庫蠓COI序列相似度為93.15%，低于98%，且在基于COI構建的NJ樹中，Bakhoum鑒定的似同庫蠓[17]聚在同一分支的支持度僅90%，其個體間COI序列差異較大，說明Bakhoum[17]、Harrup[20]鑒定的似同庫蠓可能不準確；同理，本研究組的環斑庫蠓形態特征與《中國蠓科昆蟲》[2]的環斑庫蠓相一致，而Slama D鑒定的環斑庫蠓[21]形態特征與本研究的環斑庫蠓不一致，說明Slama D鑒定的環斑庫蠓[21]可能不準確，因此上傳基因序列到數據庫前，應該盡量通過形態學的反復鑒定和確認。在構建的2個基因NJ樹中，雖然不同蠓屬聚在同一大支，但不同蠓種間無交叉，且相同蠓種的不同個體均聚在同一分支下，支持率達到99%以上，說明COI和Cytb基因只適于蠓蟲種級的鑒定。撫須庫蠓、霍飛庫蠓、荒川庫蠓、環斑庫蠓雌蟲COI基因、Cytb基因序列與雄蟲序列聚在同一分支下且相似度98%以上，說明同一種的雌雄庫蠓之間COI基因、Cytb基因的差異小于種間的差異，這與COI基因、Cytb基因用于其它昆蟲的研究結果相似[29-32]，可以用于雌蟲的種類鑒定。

線粒體COI基因和Cytb基因分子標記已應用于多種醫學昆蟲近似種的鑒定與區別[26-28]，由于分子標記不受性別、早期階段的形態結構、肢體殘缺的蟲體、鑒定者專業性的的影響[33]，形態學與分子學相結合的方法鑒別庫蠓，可以相互驗證，使結果更為準確，為庫蠓的鑒別提供了準確高效的方法。

利益沖突：無