MDCK懸浮細胞制備及流感病毒敏感性研究

李自良，王家敏，趙彩紅，王美皓，李 莉，張雪梅，李 倬，靳冬武，馬忠仁，喬自林

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1細胞 貼壁培養型MDCK細胞：從ATCC引進，引進后由甘肅省動物細胞技術創新中心按《中國藥典》2010版的要求建立主細胞庫(MDCK-M-60，P60)和工作細胞庫(MDCK-W-63，P63)；用含10%FBS(V/V)的DMEM培養基培養。

懸浮培養型MDCK細胞：本課題組自主馴化、凍存，并命名為MDCK-XF02細胞；用MDCK-SFM-(CFM-402)無血清培養基培養。

1.1.2病毒 疫苗生產用流感病毒：A/California/7/2009 X-179A(H1N1)；A/Texas/50/2012 X-223A(H3N2)；B/Phuket/3073/2013(B/P)；B/Brisbane/60/2008( BX-35)；疫苗生產用禽流感病毒：H5亞型Re-5、H5亞型Re-6、H5亞型Re-10。

1.1.3培養基與血清 DEME(high-glucous)培養基：購自蘭州百靈生物技術有限公司；血清(FBS)：購自蘭州民海生物工程有限公司；MDCK-SFM-(CFM-402)無血清培養基：購自蘭州百靈生物技術有限公司。

1.1.4主要試劑與儀器 TrypLE 胰蛋白酶替代物(1X)，貨號：12563-029，購自Gibco公司。0.2%臺盼藍，購自Sigma公司；二甲基亞砜(Thermo Scientific)；TPCK-胰蛋白酶，購自Sigma公司。

CKX-41型生微倒置顯微鏡(Olympus)、3111型CO2培養箱(ThermoFisher)、IC1000細胞計數儀(Countstar)，ZCZY-AS8型震蕩培養箱(上海知楚儀器)、BioFlo 320型5L生物反應器(Eppendorf)。

1.2 方 法

1.2.1MDCK細胞低血清適應培養和馴化 用含10%FBS(V/V，下同)的DMEM培養基復蘇貼壁培養型MDCK細胞(MDCK-W-63)，待細胞長滿單層后，用0.25%胰蛋白酶(m/m)消化分散細胞，連續傳代培養。貼壁培養型MDCK細胞每傳代培養兩代培養基中FBS濃度降低1%，至最終培養基中的FBS濃度為1%。

1.2.2MDCK細胞無血清懸浮培養和馴化 從血清濃度降到1%適應傳代培養兩代后，消化液由胰蛋白酶換為TrypLE胰蛋白酶替代物，并逐步減少DMEM的量(含1%FBS)，逐步增加無血清培養基的量，培養基中的DMEM的量(含1%FBS)組分比例降低為20%再繼續傳代培養兩代。之后傳代培養時開始擴大細胞培養，細胞總數達2.0×108cells以上時，消化離心后用無血清培養基調整細胞密度為3.0×106cells/mL，取50 mL細胞懸液用150 mL錐形瓶在37 ℃、5%CO2和110 r/min搖床懸浮培養，每天離心更換無血清培養基1次。待懸浮培養MDCK細胞的活細胞密度達6.0×106cells/mL以上時離心后按2.0×106cells/mL密度分瓶培養，以此連續傳代，每分瓶培養1次記為一次傳代培養。

1.2.3MDCK-XF02細胞的凍存、復蘇與活率檢測 常規方法凍存、復蘇并檢測細胞活率[14]。

1.2.4MDCK-XF02細胞生長曲線繪制、生長動力學分析及連續傳代穩定性驗證 MDCK-XF02細胞復蘇培養3代后，以不同密度接種，置搖床(37 ℃、5% CO2、110 r/min)懸浮培養，每個接種密度平行3組，每12 h取樣計數，繪制細胞生長曲線。并比較不同密度接種培養MDCK-XF02細胞的最大増殖密度、倍增時間[15]、比生長速率[16]。并以最佳接種密度接種連續傳代培養10代，平行3組，每24 h取樣計數，繪制細胞生長曲線。

倍增時間=T/A，A=log2(Y/X)

X為初始接種細胞數，Y為細胞最大増殖密度前一天的細胞數，T為培養時間。

比生長速率=(lnXn/Xn-1)/(tn-tn-1)

X為活細胞密度，t為培養時間，n和n-1為2個取樣計數時間點。

1.2.55L生物反應器放大培養 將傳代培養至不同代次的MDCK-XF02細胞按最佳接種密度接種于5 L生物反應器，設定培養參數，溫度37 ℃，轉速120 r/min，pH 7.2，Do(Dissolved oxygen) 40%，通氣量0.002-1 VVM(Air Volume/culture volume)/min。每24 h取樣計數，繪制細胞生長曲線。比較最大増殖密度、倍增時間、比生長速率。

1.2.6MDCK-XF02細胞增殖流感和禽流感病毒敏感性研究 MDCK-XF02細胞生長至密度(8.0～10.0)×106cells/mL時，用無血清培養基稀釋至密度為(4.0～5.0)×106cells/mL，按病毒感染復數(MOI)0.01接種四種型別的流感病毒和三種型別的禽流感病毒并添加2.5 μg/mL TPCK胰蛋白酶，每種病毒平行3組，置于34 ℃、5% CO2、110 r/min培養。病毒接種24 h、36 h、48 h、60 h測定血凝效價(HA)和半數細胞感染量(CCID50)，拍照觀察細胞形態和病變程度，并繪制不同時間HA、CCID50圖。

2 結 果

2.1MDCK細胞低血清適應培養和馴化 貼壁培養型MDCK細胞(MDCK-W-63)逐步降低培養基中胎牛血清濃度，(從P64代傳代培養至P83代，共計連續低血清適應培養20代。因降低FBS濃度使細胞生長速度變慢，傳代比例也相應降低。其中P64-P69代以1∶6的比例傳代培養；P70-P75代以1∶5的比例傳代培養；P76-P83代以1∶4的比例傳代培養。)至P83代時已適應了1%FBS培養，按1∶4比例傳代培養時，48 h仍可生長成單層細胞，細胞形態與10%FBS培養時相似，但細胞長成單層時相互擠壓或重疊現象不如10%FBS培養時明顯。如圖1A和1B所示。

圖1 馴化前后MDCK細胞形態對比(A:10%FBS，B:1%FBS，C:MDCK-XF02)Fig.1 Morphological comparison of MDCK cells before and after domestication

2.2MDCK細胞無血清懸浮培養和馴化 血清濃度降到1%適應傳代培養兩代后(P82、P83代)，從P84代傳代培養至P98代，共計連續無血清懸浮馴化培養15代。至P96代傳代時開始擴大細胞培養量，至P98時細胞總數達2.0×108個以上，消化離心后全用無血清培養基調整細胞密度為3.0×106cells/mL。至P99代時細胞適應無血清培養，在無血清培養基中懸浮培養活力高、結團少、均一性好，經6次換液后基本適應了懸浮條件下培養，細胞生長速度變快，第9次換液后培養24 h，細胞密度達6.3×106cells/mL。懸浮培養的MDCK細胞(P99代)第一次傳代后以2.0×106cells/mL接種培養生長速度逐步加快，如圖2所示。

圖2 懸浮培養型MDCK細胞(P100-P103代)生長密度Fig.2 Growth density of suspension cultured MDCK cells (P100-P103 generation)

2.3MDCK-XF02細胞的凍存、復蘇和活力檢測結果 懸浮培養的MDCK細胞無血清傳代培養至P103代時凍存300支，凍存密度為5.4×107cells/mL，細胞活力為92.15%，將馴化的懸浮培養型MDCK細胞株命名為：MDCK-XF02。凍存的MDCK-XF02細胞復蘇活力達91.22%，復蘇后細胞形態呈圓形，細胞邊緣整齊，大小較均一，如圖1C所示。

2.4MDCK-XF02細胞生長曲線繪制、生長動力學分析及傳代穩定性驗證 MDCK-XF02細胞復蘇培養3代后，以0.5×106cells/mL、1.0×106cells/mL、1.5×106cells/mL、2.0×106cells/mL、3.0×106cells/mL的密度接種培養，細胞生長均快，生長曲線成近“S”型，如圖3所示。細胞經過12 h的潛伏期，此后迅速進入對數生長期，不同密度接種平臺期維持時間不同，之后細胞密度迅速下降，進入衰亡期。

比生長速率如圖3所示，分別為(0.034±0.011)h-1、(0.025±0.022)h-1、(0.022±0.02)h-1、(0.019±0.020)h-1、(0.016±0.025)h-1。不同接種密度培養MDCK-XF02細胞均在36 h時達到最大比生長速率，最大比生長速率分別為(0.056±0.007)h-1、(0.056±0.019)h-1、(0.056±0.009)h-1、(0.047±0.007)h-1、(0.055±0.008)h-1。隨后比生長速率迅速下降，在60 h時3.0×106cells/mL的密度接種培養的MDCK-XF02細胞比生長速率已降低為(-0.002±0.005)h-1。

最大增殖密度如圖4所示，不同密度接種培養MDCK-XF02細胞的最大增殖密度分別為(13.40±0.70)×106cells/mL、(13.17±1.36)×106cells/mL、(13.67±0.76)×106cells/mL、(14.03±1.19)×106cells/mL、(13.93±0.55)×106cells/mL。比較發現不同密度接種培養MDCK-XF02細胞的最大增殖密度差異無統計學意義(P>0.05)。

倍增時間如圖4所示，分別為(18.96±0.35)h、(20.04±0.56)h、(20.25±1.30)h、(22.29±0.30)h、(21.40±0.83)h。不同密度接種培養MDCK-XF02細胞的倍增時間隨著接種密度的增大逐漸增加，接種密度高低會直接影響細胞的生長周期，接種密度過高導致細胞快速達到最大增值密度，大量細胞代謝副產物極劇增加，迅速進入衰亡期。接種密度過低會導致培養時間增加，大大增加了生產成本和污染風險。選擇合適倍增時間不僅有利于細胞最佳的生長狀態也有利于生產實際結合，降低生產成本。

圖3 不同接種密度培養MDCK-XF02細胞生長曲線和比生長速率Fig.3 Growth curve and specific growth rate of MDCK-XF02 cells inoculated with different densities

圖4 不同接種密度培養MDCK-XF02細胞最大增殖密度和倍增時間Fig.4 Maximum proliferation density and doubling time of MDCK-XF02 cells cultured in different densities

傳代穩定性如圖5所示，以(1.0～2.0)×106cells/mL細胞密度接種后生長48 h細胞密度均能達到(11.08±0.24)×106cells/mL，在連續傳代培養的過程中細胞形態和生長狀況接近一致，P110-P120代MDCK-XF02細胞的比生長速率差異均無統計學意義(P>0.05)。

圖5 MDCK-XF02細胞傳代穩定性Fig.5 MDCK-XF02 cell passage stability

綜合以上對MDCK-XF02細胞株不同接種密度培養生長曲線繪制及生長動力學分析發現，以(1.0～2.0)×106cells/mL細胞密度接種培養效果最佳，不僅有利于細胞最佳的生長狀態也有利于生產實際結合，降低生產成本；連續傳代培養結果說明，在無血清懸浮培養基中MDCK-XF02細胞能連續傳代培養且生長動力學較穩定；從病毒擴增和疫苗生產方面來說，以(1.0～2.0)×106cells/mL細胞密度接種有利于更好的控制細胞代謝產物和穩定的培養環境，從而使得單位細胞病毒產率達到最大。當然，對單位細胞病毒產率的影響因素還有許多，但就從細胞接種密度的選擇上，MDCK-XF02細胞株以(1.0～2.0)×106cells/mL細胞密度接種最佳。

2.55L反應器放大培養 MDCK-XF02細胞傳代至P110、P120、p130代按2.0×106cells/mL接種于5L生物反應器，細胞生長狀態良好，大小均一。細胞生長曲線如圖6所示，從圖中可以看出生長曲線近呈“S”型，培養至72 h時細胞密度達到最大值：比生長速率分別為(0.027±0.012)h-1、(0.028±0.013)h-1、(0.028±0.013)h-1差異無統計學意義(P>0.05)，如圖6。倍增時間、最大増殖密度結果見表1；結果顯示，線性放大過程中，MDCK-XF02細胞生長動力學較穩定。

圖6 5L生物反應器培養不同代次MDCK-XF02細胞生長曲線和比生長速率Fig.6 Growth curve and specific growth rate of different generations of MDCK-XF02 cells cultured in 5L bioreactor

表1 5L生物反應器培養不同代次MDCK-XF02細胞倍增時間和最大增殖密度

Tab.1 doubling time and maximum proliferation density of different generations of MDCK-XF02 cells cultured in 5L bioreactor

Cell generationP110P120P130Multiplication time/h20.46±0.6519.94±0.3720.02±0.17Maximum proliferation concentra-tion(×106 cells/mL)13.97±0.3214.57±0.4714.40±0.19

2.6MDCK-XF02細胞增殖流感和禽流感病毒敏感性研究 MDCK細胞目前應用最廣泛的流感研究細胞系之一，然而，MDCK細胞對不同流感和禽流感病毒株的敏感性并不相同，病毒的增殖效率也受到限制。值得關注的是，MDCK-XF02細胞增殖流感和禽流感病毒動力學顯示，在感染后36～48 h達到最大滴度，允許在早期收獲，從而從一定程度上減輕了下游純化工藝的難度。流感病毒B/P在36 h達到最大病毒顆粒釋放量的特異性生產動力學。我們的研究結果表明，MDCK-XF02細胞系是一個非常有應用價值的工業化生產流感和禽流感疫苗的細胞株。

2.6.1流感病毒敏感性 不同時間HA、CCID50見圖7，MDCK-XF02細胞接種H1N1和H3N2均能很好的生長，培養24 h HA效價(log2HA/25 μL)為4～5、CCID50為(2.27～2.59)lgCCID50/mL，60 h時 HA效價(log2HA/25 μL)為6～7、CCID50為(4.35～4.68)lgCCID50/mL；接種流感病毒B/P和BX-35增殖更快，36 h HA效價(log2HA/25 μL)均為8、CCID50分別為7.31lgCCID50/mL、5.53lgCCID50/mL，60 h時HA效價(log2HA/25 μL)達到9～10，CCID50分別為6.14lgCCID50/mL、6.38lgCCID50/mL。

如圖8所示，接毒后24 h細胞出現皺縮，結團現象，36 h時細胞大量結團，生長停滯。48～60 h細胞開始崩解、出現大量細胞碎片。接種不同型別的流感病毒其病變過程相似，但病變程度強弱有差異。

2.6.2禽流感病毒敏感性 懸浮培養型MDCK-XF02細胞接種重組禽流感病毒H5亞型Re-5、H5亞型Re-6、H5亞型Re-10均能很好的生長，培養24 h HA效價(log2HA/25 μL)為4～5、CCID50為(4.11～4.37)lgCCID50/mL，60 h時HA效價(log2HA/25 μL)為7～9、CCID50達到(6.21～6.96)lgCCID50/mL；不同時間HA、CCID50見圖9。

圖7 MDCK-XF02細胞株增殖流感感病毒的HA和CCID50Fig.7 MDCK-XF02 cell line proliferating influenza virus HA and CCID50

圖8 病毒致MDCK-XF02細胞病變(A: 0 h, B: 12 h, C: 24 h, D: 36 h, E: 48 h, F: 60 h)Fig.8 Cytopathic effect of MDCK-XF02 (A: 0 h, B: 12 h, C: 24 h, D: 36 h, E: 48 h, F: 60 h)

圖9 MDCK-XF02細胞株增殖禽流感病毒的HA和CCID50Fig.9 MDCK-XF02 cell line proliferating avian influenza virus HA and CCID50

3 討 論

MDCK細胞為貼壁培養型細胞，需要添加血清才能正常生長。無血清懸浮培養工藝的難點是將原始的含血清貼壁培養型細胞系馴化為無血清懸浮培養型細胞株；本研究首先對ATCC引進的貼壁培養型MDCK細胞系通過低血清適應培養和馴化至最終培養基中的FBS濃度由10%降為1%，后用無血清培養基懸浮培養和馴化，最終成功得到了一株新型的無血清懸浮培養型MDCK-XF02細胞株，進一步從搖瓶擴大至生物反應器培養。并用MDCK-XF02細胞株作為底物接種四種型別的流感病毒和3種型別的禽流感病毒，初步研究了該細胞株對流感和禽流感病毒的增值特性。從搖瓶懸浮培養擴大至5L生物反應器培養過程中MDCK-XF02細胞的生長曲線繪制及生長動力學分析發現，接種密度高低會直接影響細胞的生長周期，以(1.0～2.0)×106cells/mL細胞密度接種培養效果最佳。MDCK-XF02細胞株作為底物接種流感病毒和禽流感病毒的初步應用中發現，該細胞株能夠增殖流感和禽流感病毒且增殖效果好。

細胞培養是目前公認的最經濟、快速和安全的病毒增殖方法。近年來，生物反應器大規模細胞技術的快速發展，與傳統轉瓶和細胞工廠培養相比表現出了明顯優勢，用生物反應器培養細胞和增殖病毒已成為疫苗生產工藝的首選。無論是微載體培養、片狀載體培養，還是低血清懸浮培養，因培養基中含有動物來源的血清成份對疫苗接種者有副反應和其它安全風險，所以，無血清懸浮培養是疫苗生產最青睞的工藝，而且還可以線性放大，應用價值巨大，對流感疫苗和禽流感疫苗的工業生產意義重大[17]。

利益沖突：無