豬鏈球菌9型分離株的耐藥性及耐藥基因分析

關 琳，王丹丹，祝昊丹，周俊明，孫 珂，呂立新，俞正玉，何孔旺，李 彬，倪艷秀

豬鏈球菌(Streptococcussuis)是一種重要的人獸共患病原菌，根據莢膜多糖抗原的不同，將豬鏈球菌分為33個不同的血清型，包括1-31型、33型及1/2型[1]，其中1型、2型、7型和9型在臨床上較為常見。近年來，豬鏈球菌9型(Streptococcussuisserotype 9，SS9)在我國流行越來越廣泛[2-3]，并且泰國曾報道已有人感染豬鏈球菌9型菌株[4]。抗生素作為治療豬鏈球菌的首選方法，被應用于豬的飼養生產中，但抗生素的廣泛應用以及不合理的使用，使得豬鏈球菌對各類抗生素的耐藥性逐漸增強，甚至出現多重耐藥，給臨床治療帶來了困難[5-7]。而且耐藥性可通過食物鏈傳遞給人類，使耐藥性在人畜之間進行傳遞，對人類健康也產生巨大的威脅，耐藥性問題已成為全球關注的熱點。

國內外研究表明從不同國家不同地區分離出的豬鏈球菌對抗生素耐藥性存在不同，但大多數對四環素類、大環內酯類、磺胺類以及林可胺類都具有較強的耐藥性[8]。由于細菌受到抗生素強大的選擇，從而使動物體內的病原菌與正常豬鏈球菌相互作用，逐漸產生了不同的耐藥機制。研究表明，同一種抗生素可能存在多種耐藥機制，一種耐藥機制也可能在不同種抗生素中發揮作用[9]。對于豬鏈球菌的耐藥機制產生的因素較多，主要包括遺傳因素、化學因素及環境因素的影響。因此了解豬鏈球菌的耐藥性及耐藥機制，從根源減少耐藥菌株的產生具有重要意義。

目前，對于豬鏈球菌的耐藥性研究的菌株多為豬鏈球菌2型，未見專門對豬鏈球菌9型耐藥性的分析。本試驗通過紙片擴散法和PCR技術檢測了豬鏈球菌9型的耐藥性及相關耐藥基因，以期為豬鏈球菌9型的預防和臨床治療提供參考，減少耐藥菌株的出現。

1 材料與方法

1.1菌株來源 22083為豬鏈球菌9型參考菌株，GZ0565與SH040917由南京農業大學惠贈，其余菌株由本實驗室分離鑒定并保存，菌株信息見表1。藥敏質控菌為金黃色葡萄球菌ATCC29213，由本實驗室保存。

1.2主要儀器與試劑 超凈工作臺購自蘇凈集團安泰公司；DNP-9272 型電熱恒溫培養箱購自上海精宏試驗設備有限公司；搖床購自太倉市強樂實驗設備有限公司；PCR儀購自Takara公司；Todd-Hewitt Broth(THB)購自美國BD公司；Mueller-Hinton Broth(MHB)培養基購自北京陸橋技術有限公司；無菌脫纖維馬血購自美國Thermo公司，瓊脂粉購自索萊寶科技有限公司；基因組提取試劑盒為OMGA公司產品；2× Premix Taq和DL2,000 DNA Marker購自Takara公司，藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

THB液體培養基參照產品說明書配置，THB平板于液體培養基中添加1.5%瓊脂粉經高壓滅菌；MH血平板于MHB液體培養基中添加1.5%瓊脂粉經高壓滅菌后，取出，室溫冷卻至50 ℃左右，加入5%的無菌脫纖維馬血。

1.3菌株培養 將SS9菌株凍存液連續在THB中傳2代復壯后，采用三區劃線接種于THB平板上，37 ℃過夜培養，分別用無菌接種環挑取形態學上相似的菌落到無菌的生理鹽水中以獲得懸浮液，將菌液調至0.5個麥氏濁度，濃度約1×108CFU/mL～2×108CFU/mL，15 min內使用。

表1 菌株來源

Tab.1 Source of strains

菌株名稱來源地區分離時間組織22083病豬丹麥不詳肺GZ0565病豬廣東廣州2005 腦SDQD080923病豬山東青島2008.09.23肺GDZQ140619病豬廣東肇慶2014.06.19心GDZQ140705病豬廣東肇慶2014.07.05心GDKP140715病豬廣東開平2014.07.15肺GDZQ140716病豬廣東肇慶2014.07.16心GDKP140725病豬廣東開平2014.07.25肺JSSQ151224病豬江蘇宿遷2015.12.24肺JSSY160913病豬江蘇泗陽2016.09.13肺JSJJ170109病豬江蘇靖江2017.01.09肺SH040917健康豬上海2004扁桃體JSJY1608健康豬江蘇江陰2016.08鼻拭子JSNT1608健康豬江蘇南通2016.08鼻拭子JSCZ170720健康豬江蘇常州2017.07.20鼻拭子

1.4耐藥性檢測 采用紙片擴散法檢測15株SS9菌株對9類21種不同抗生素的耐藥性，根據美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)規定的方法進行操作，具體步驟為：以無菌棉拭子蘸取菌株稀釋液，在管壁的內側擠去棉棒上多余的水分，從3個方向上均勻涂布整個MH血平板表面。然后用無菌的鑷子夾取藥敏紙片，將其貼在平板表面。將平板置于37 ℃培養18～24 h后，測定抑菌圈直徑大小。根據產品說明書判定菌株的耐藥性。

1.5耐藥基因檢測 根據NCBI上的基因序列設計引物，通過PCR方法對豬鏈球菌血清9型菌株的四環素耐藥基因(tetM，tetO)和大環內酯類耐藥基因(mefA，ermB，mrsD)進行分析。引物由上海Invitrogen公司合成。PCR反應體系為：2× Premix Taq 12.5 μL，10 pmoL/mL上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，無菌ddH2O補足至25 μL。反應體系：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72℃延伸1 min 45 s，30個循環后再72 ℃延伸5 min。引物序列、退火溫度及片段大小見表2。

表2 擴增豬鏈球菌9型耐藥基因引物序列

Tab.2 Primers sequences of drug resistance gene for PCR

抗生素種類耐藥基因引物序列(5′-3′)片段大小/bp四環素類tetMAGTTTTAGCTCATGTTGA1 800TCCGACTATTTGGACGACGGtetOAACTTAGGCATTCTGGCTCAC515TCCCACTGTTCCATATCGTCA大環內酯類mefAAGTATCATTAATCACTAGTGC348TTCTTCTGGTACTAAAAGTGGermBGAAAAGGATCTCAACCAAATA639AGTAACGGTACTTAAATTGTTTACmrsDCCTTATCGGCACAGGTTCAT500GCCTTCCGGAGCTCCTACTT

2 結 果

2.1耐藥性檢測結果 15株豬鏈球菌9型的耐藥性如表3所示，菌株對大環內酯類(紅霉素、阿奇霉素、乙酰螺旋霉素)、林可胺類(克林霉素、林可霉素)均100%耐藥，對四環素、鏈霉素耐藥性較高，耐藥率都為93.3%，對β-內酰胺類中的阿莫西林和頭孢類抗生素、氯霉素類、糖肽類以及慶大霉素較為敏感。

表3 15株豬鏈球菌9型的耐藥性分析

Tab.3 Results of drug resistance of 15 SS9 strains

抗生素種類抗生素名稱英文縮寫敏感(株)中介(株)耐藥(株)耐藥率(%)β-內酰胺類青霉素GP26746.67阿莫西林AMX14100.00頭孢吡肟CPE120320.00頭孢唑啉CZ121213.33頭孢克洛CF120320.00糖肽類萬古霉素VA130213.33氨基糖苷類丁胺卡那AK52853.33卡那霉素KAN09640.00慶大霉素GM130213.33鏈霉素S011493.33大環內酯類紅霉素E0015100.00阿奇霉素AZM0015100.00乙酰螺旋霉素ASP0015100.00四環素類四環素TE011493.33多西環素DOX131173.33表3(續)抗生素種類抗生素名稱英文縮寫敏感(株)中介(株)耐藥(株)耐藥率(%)喹諾酮類環丙沙星CIP29426.67香豆素類新生霉素NV6900.00氯霉素類氯霉素CHL112213.33氟苯尼考FFC11316.67林可胺類林可霉素MY0015100.00克林霉素CLI0015100.00

2.2多重耐藥性分析 15株豬鏈球菌9型均多重耐藥，且均在7重及7重耐藥以上，最高可耐16重藥物；8重耐藥的菌株數最多，共有6株；耐7、9、10、11、13重抗生素的菌株各有1株；耐12、16重抗生素的菌株各有2株。結果如表4所示。

表4 15株豬鏈球菌9型的多重耐藥性結果

Tab.4 Results of multidrug resistance of 15 SS9 strains

菌株耐藥譜耐藥重數22083AK+KAN+S+E+AZM+ ASP+MY+CLI8GZ0565P+CPE+CF+VA+AK+E+AZM+ASP+TE+DOX+MY+CLI12SDQD080923P+S+E+AZM+ ASP+TE+DOX+MY+CLI9GDZQ140619S+E+AZM+ ASP+TE+DOX+MY+CLI8GDZQ140705S+E+AZM+ASP+TE+DOX+MY+CLI8GDKP140715S+E+AZM+ASP+TE+DOX+MY+CLI8GDZQ140716S+E+AZM+ASP+TE+DOX+MY+CLI8GDKP140725S+E+AZM+ASP+TE+MY+CLI7JSSQ151224AK+S+E+AZM+ASP+TE+DOX+CIP+MY+CLI10JSSY160913P+CPE+CF+AK+KAN+GM+S+E+AZM+ASP+TE+DOX+CIP+CHL+MY+CLI16JSJJ170109P+AK+S+E+AZM+ASP+TE+CIP+CHL+MY+CLI11SH040917P+CZ+AK+KAN+S+E+AZM+ASP+TE+DOX+MY+CLI12JSJY1608KAN+S+E+AZM+ASP+TE+MY+CLI8JSNT1608P+CPE+CZ+CF+AK+KAN+GM+S+E+AZM+ASP+TE+DOX+CIP+MY+CLI16JSCZ170720P+VA+AK+KAN+S+E+AZM+ASP+TE+DOX+FFC+MY+CLI13

2.3耐藥基因檢測結果 對四環素耐藥基因(tetM，tetO)、大環內酯類耐藥基因(mefA，ermB，mrsD)的PCR檢測結果見表5，由此可知，15株菌中，除了22083外，其他菌株均檢測到tetO基因，而僅有1株菌(JSNT1608)存在tetM基因。所有分離株均擴增到ermB基因，而mefA基因僅在1株菌(JSJJ170109)中檢測到，mrsD基因僅在3株細菌中檢測到。tetO、ermB基因擴增結果分別見圖1、圖2。

表5 大環內酯類和四環素類耐藥基因攜帶情況

Tab.5 Detecting results of macrolide and tetracycline resistance genes by PCR

抗生素種類耐藥基因PCR陽性菌株數陽性率(%)四環素類tetM16.67tetO1493.33大環內酯類mrsD320.00mefA16.67ermB15100.00

M:DL2000 DNA Marker；1-15:檢測樣品；16:陽性對照；17:陰性對照圖1 tetO耐藥基因檢測結果Fig.1 Detecting results of tetO resistance gene

M:DL2000 DNA Marker；1-15:檢測樣品；16:陽性對照；17:陰性對照圖2 ermB耐藥基因檢測結果Fig.2 Detecting results of ermB resistance gene

3 討 論

本研究發現該15株SS9對大環內酯類及林可胺類耐藥率均為100%，對四環素類耐藥率高達93.3%，對頭孢類、氯霉素類、阿莫西林、糖肽類以及慶大霉素較為敏感。所有菌株均達到7重耐藥，8重耐藥菌株共有6株，16重耐藥菌株有2株，說明SS9的耐藥情況十分嚴重；分離自廣東地區患病豬的菌株以8重耐藥為主，而分離自江蘇的菌株最少為8重耐藥，甚至達到16重耐藥，說明不同地區9型豬鏈球菌耐藥性存在較大差異；分離自健康豬的菌株其多重耐藥率要高于分離自患病豬菌株的耐藥率。結果表明，SS9的耐藥情況十分嚴重，這可能是由于我國廣泛使用抗生素，甚至濫用，使細菌長期接觸，因此產生耐藥性。因此臨床用藥時應盡量避免使用大環內酯、林可酰胺類及四環素類等抗生素，合理選擇對細菌較為敏感的藥物，以免SS9在我國呈暴發性流行。

大環內酯類抗生素的抗菌機制是其進入細胞后結合于核糖體50S大亞基，抑制肽酰基轉移酶，從而阻礙細菌蛋白質的合成。豬鏈球菌對大環內酯類抗生素的耐藥機制主要是主動外排機制和靶位修飾[10]。主動外排機制主要是由于細菌體內外滲透壓不同，細菌在能量存在下經細胞膜將菌體內高濃度的藥物排出體外，從而使自身適應外界環境。對革蘭氏陽性菌而言，這一過程主要由轉運子超家族的mrs及易化子超家族成員mef基因編碼產生[11-12]。mefA為近年來常見的豬鏈球菌耐藥基因，其位于染色體 DNA 上，大小為 1 218 bp，下游為msrD基因，大小為 1 464 bp[13]。試驗結果顯示15株耐藥菌株中僅有1株細菌JSJJ170109具有mefA基因，有3株菌株具有msrD基因，表明豬鏈球菌9型菌株對大環內酯類耐藥機制并非為主動外排。靶位修飾是一種甲基化過程，主要是由于細菌靶位23S rRNA的特定氨基酸被erm酶甲基化后，核糖體構象改變，阻斷了大環內酯類藥物與靶位結合，從而導致豬鏈球菌耐藥性產生。最早發現的豬鏈球菌甲基化酶為ermB基因，后又發現了其同源性ermA基因。試驗結果顯示15株耐藥菌株的ermB基因檢出率為100%，表明該15株菌株對大環內酯類抗生素耐藥的機制主要是ermB基因甲基化的結果。

細菌對四環素的耐藥機制主要有主動核糖體保護蛋白機制、外排蛋白機制、鈍化或滅活四環素酶機制[14]以及16S rRNA基因位點突變影響等[15]，由不同的tet耐藥基因決定，其中國內外研究表明豬鏈球菌對四環素的耐藥機制主要為核糖體保護蛋白機制[16]。目前對tetM和tetO基因的研究最多，且豬鏈球菌對四環素的耐藥基因主要為此兩種基因[17-18]。談忠鳴等[19]在2015年對1998-2010年分離自江蘇的27株豬鏈球菌2型(SS2)進行耐藥性分析中發現，所有菌株對四環素都耐藥，只有1株菌存在tetO基因，其余均存在tetM基因。而本試驗研究結果發現15株SS9中有14株存在tetO基因，僅有1株存在tetM基因。這表明盡管2種血清型的豬鏈球菌對四環素的耐藥性都很高，但引起耐藥的基因是不同的，SS2對四環素產生極高耐藥率的基因主要是tetM基因，而SS9主要是tetO基因。

本研究為豬鏈球菌9型的預防和臨床治療、耐藥性及耐藥機制的研究提供了參考依據。

利益沖突：無