重慶地區耐多藥結核分枝桿菌三種二線注射類藥物耐藥相關基因特征分析

胡 彥，劉 潔，馮 鑫，沈 靜，余鋒平，陳立書

耐藥結核病尤其是耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)是嚴重危害公眾健康的疾病。我國是全球30個MDR-TB高負擔國家之一，2017年估算我國新發結核病患者88.9萬例，耐多藥/利福平耐藥結核病(MDR/RR-TB)患者7.3萬例，新患者和復治患者MDR/RR-TB的發生率分別為7.1%和24%[1]。重慶地區MDR-TB發生率為23.0%[2]，是結核病和耐藥結核病的高發區。

二線注射類藥物是組成MDR-TB治療方案的重要藥物之一，在進行短程化療方案之前，注射類藥物的耐藥性應常規檢測[3-4]。傳統藥敏耗時長，應用快速可靠的分子檢測技術成為必然趨勢。由于不同地區菌株研究人群、流行病學和藥物實際使用情況等不同，菌株耐藥相關基因突變位點存在地域差異。此外，北京基因型菌株是中國的主要流行株，有更高的耐藥基因突變頻率，在耐藥結核病的傳播中起著重要作用[5-7]，因此明確重慶地區注射類藥物耐藥表型與基因突變的相關性，并對不同基因型的耐藥突變位點進行分析，將為本地區合理應用分子生物學技術進行注射類藥物耐藥性檢測及合理制定MDR-TB化療方案提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1菌株來源 收集2015年1月至2017年6月重慶市39個區(縣)結核病防治機構967例痰涂片抗酸桿菌陽性的MDR-TB可疑患者臨床分離株，經菌種鑒定及比例法藥敏試驗，確定為MDR-TB菌株229株(23.7%)，分離自229例MDR-TB患者。男173例，女56例；年齡17～79歲，平均(45.0±15.9)歲；初治患者84例，復治患者145例。結核分枝桿菌標準菌株 H37Rv(ATCC27294)來源于中國疾病預防控制中心，國家結核病參比實驗室。

1.1.2主要儀器和試劑 PCR儀購自杭州博日公司，Middle brook 7H9培養基購自美國BD公司，Alamar blue顯色液購自美國Bio-Rad公司，卡那霉素(Km)、阿米卡星(Am)和卷曲霉素(Cm)藥粉購自美國Sigma公司。

1.2 方 法

1.2.1藥敏試驗 使用7H9液體培養基(7H9∶OADC=9∶1)，通過微孔板Alamar blue顯色法測定注射類藥物的MIC值。Km、Cm濃度梯度設置：0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL；Am濃度梯度設置：0.63、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL。刮取改良L-J(Lowenstein-Jenden)培養基上肉眼可見后1至2周的新鮮菌落，進行磨菌、比濁，制備1個麥氏單位濃度的菌懸液，50倍稀釋后取100 μL接種到不同濃度梯度的7H9液體培養基中。37 ℃培養7 d后，加入70 μL顯色劑(Alamar blue∶5% Tween 80=2∶5)，24 h后觀察顏色變化判斷MIC讀數。MIC界定標準：藍色完全沒有發生改變的為最小藥物濃度。耐藥臨界濃度參照文獻[8-9]設置，Km、Cm為2.5 μg/mL，Am為1.0 μg/mL。

1.2.2耐藥基因擴增和測序 結核分枝桿菌標準菌株H37Rv的rrs、eis、tlyA基因序列在NCBI主頁(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的DNA序列數據庫(GenBank )中査取獲得，使用Primer 6.0軟件進行引物序列設計，由北京擎科生物技術有限公司合成，引物信息見表1。PCR反應體系為50 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 25 μL、引物各1 μL，DNA模板3 μL，去離子水20 μL。PCR 擴增條件：94 ℃變性5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃ 1 min，35個循環；再72 ℃延伸10 min。PCR產物送北京擎科公司進行測序。測序結果通過BioEdit (Version 7.1.3.0)軟件與標準菌株H37Rv的基因序列進行比對分析。

1.2.3熒光PCR-熔解曲線基因分型 Rv2952基因用于鑒定北京與非北京基因型。參照文獻[10-13]，引物和探針序列由北京擎科生物技術有限公司合成，采用10 μL反應體系：10×反應緩沖液1 μL、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 0.4 μL、上游引物0.05 μL(0.02 μmol/L)、下游引物1 μL(0.4 μmol/L)、探針0.2 μL(0.2 μmol/L)、酶 0.2 μL、DNA 0.5 μL、雙蒸水6.65 μL。反應條件：預變性95 ℃ 2 min; 變性95 ℃ 10 s，退火58 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 10 s，共40個循環，最終延伸72 ℃ 5 min。熔解曲線分析條件為：95 ℃變性5 min，40～80 ℃熔解曲線分析，每升高1 ℃采集1次熒光，檢測FAM和ROX 2個通道。

表1 PCR擴增及測序反應用的引物序列

Tab.1 PCR primer sequences used for amplification and sequencing

引物序列(5′-3′)產物長度/bpTm(℃)rrs-FGCGCAACCCTTGTCTCAT-GTTG46460rrs-RGGGGCGTTTTCGTGGT-GCTCCeis-FGCGTAACGTCACG-GCGAAATTC56758eis-RGTCAGCTCATGCAAGGTGtlyA-FGCATCGCACGTCGTCTTT94758tlyA-RGGTCTCGGTGGCTTCGTC

1.2.4相關定義及結果解釋 耐多藥結核病(MDR-TB)是指至少同時對異煙肼和利福平耐藥的結核分枝桿菌引起的結核病。Km、Cm高、中、低水平耐藥，分別為MIC≥80 μg/mL、MIC=40 μg/mL、MIC=2.5～20 μg/mL。Am高、中、低水平耐藥，分別為MIC≥64 μg/mL、MIC=32 μg/mL、MIC=1～16 μg/mL[8]。

1.2.5統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，樣本率的比較用卡方檢驗或Fisher確切概率法(樣本量<40或理論頻數<1時)，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1MDR-TB菌株三種二線注射類藥物體外藥敏試驗結果 229株MDR菌株中，35株(15.3%，35/229)對至少一種二線注射類藥物耐藥。34株(14.8%，34/229)對Km耐藥，27株(11.8%，27/229)對Am耐藥(同時耐Km)，19株(8.3%，19/229)對Cm耐藥(其中，18株對Km和Am耐藥,1株對Km敏感)。

2.23種二線注射類藥物MIC分布與耐藥相關基因分子特征 35株注射類耐藥表型菌株中，28株(80.0%)發生基因突變，包括rrs、eis啟動子區和tlyA3個基因的5種突變類型。其中，21株(60%，21/35)發生rrs基因A1401G突變，突變頻率最高。該21株A1401G突變株中，18株對Km高水平耐藥，3株Km中度水平耐藥，差異有明顯統計學意義(χ2=21.429，P<0.01)；Am在21株A1401G突變株中，18株為高水平耐藥，2株中度水平耐藥，1株Am敏感，與Am高水平耐藥相比，后兩者與其差異有明顯統計學意義(χ2=24.436，P<0.01；χ2=27.776，P<0.011)。Cm在21株A1401G突變株中的MIC值范圍從0.31 μg/ml到80 μg/ml不等(高水平、低水平耐藥及敏感株分別為1株、12株和8株)。35株耐藥表型菌株中，1株發生rrs基因G1484T突變，對Km、Am均顯示為高水平耐藥，Cm顯示為低水平耐藥。在4株eis啟動子區G(-10)A突變株中，Km均為低水平耐藥；Am 1株為低水平耐藥，3株敏感；Cm 4株均為敏感。1株發生eis啟動子區C(-14)T突變，對Km、Am均顯示為低水平耐藥，對Cm敏感。1株發生tlyA基因137位堿基插入改變，對Cm低水平耐藥而對Km、Am均敏感。見表2。

2.33種二線注射類藥物耐藥表型與基因突變之間的關系 在3種注射類藥物耐藥和敏感表型間，經卡方檢驗或Fisher確切概率法檢驗，Km耐藥和敏感表型間的rrs、eis基因啟動子區突變率差異有明顯統計學意義，而Am、Cm耐藥和敏感表型間，僅rrs基因突變率差異有統計學意義，如表3所示。

2.4不同基因型菌株二線注射類藥物耐藥情況 229株MDR菌株中，北京基因型菌株190株(83.0%，190/229)，非北京基因型菌株39株(17.0%，39/229)，雖然北京型各注射類藥物耐藥率高于非北京型，但差異均無統計學意義。見表4。

表2 MDR-TB 菌株rrs、eis和tlyA基因分子特征與最低抑菌濃度分布

Tab.2 MICs for second-line injectable drugs and mutant profiles of the genesrrs,eis, andtlyAamong MDR-TB isolates

耐藥表型(株數)rrs基因突變eis啟動子區突變tlyA基因突變突變株數[n(%)]MIC (μg/mL)KmAmCmA1401G21(60.0)40.0～>80.01.0～>64.00.31～>80.0二線注射-耐藥G1484T1(2.9)>80.0>64.05.0 (35)G(-10)A4(11.4)5.0～10.00.5～2.00.63～1.25C(-14)T1(2.9)10.0 2.0 1.25 137位插入G1(2.9)2.5 0.5 5.0 Total28(80.0)2.5～>80.00.5～>64.00.31～>80.0A1449G4(2.1)1.25～2.50.25～0.50.63～2.5二線注射-敏感 Glu132Ala1(0.5)2.50.250.63 (194)396位插入A1(0.5)1.250.1251.25 Total6(3.1)1.25～2.50.125～0.50.63～2.5

表3 MDR結核分枝桿菌注射類藥物耐藥與基因突變的關系

Tab.3 Relationship between gene mutations and injectable drug resistance in MDR strains

藥物基因耐藥[n(%)]突變無突變小計敏感[n(%)]突變無突變小計χ2PKmrrs22(64.7)12(35.3)344(2.1)191(97.9)195106.78<0.01①eis5(14.7)29(85.3)340(0.0)195(100.0)195-<0.01②Amrrs21(77.8)6(22.2)274(2.0)198(98.0)202133.01<0.01①eis1(3.7)26(96.3)270(0.0)202(100.0)202 -0.12②Cmrrs14(73.7)5(26.3)1912(5.7)198(94.3)21073.37<0.01①eis0(0.0)19(100.0)195(2.4)205(97.6)210 -1.00②tlyA1(5.3)18(94.7)2102(1.0)208(99.0)210 -0.23②

注： ①校正卡方檢驗，②Fisher確切概率法

表4 不同基因型二線注射類藥物耐藥情況

Tab.4 Second-line injectable drugs resistance among Beijing and non-Beijing genotypes

基因型耐藥株數[n(%)]KmAmCm北京型(n=190)31(16.3)24(12.6)16(8.4)非北京型(n=39)3(7.7)3(7.7)3(7.7)χ2值1.0930.358 0.000 P值0.1680.5491.000

2.5不同基因型菌株二線注射類藥物耐藥基因突變情況 在35株注射類藥物耐藥菌株中，北京型和非北京型分別為31株(88.6%)和4株(11.4%)。在31株北京基因型菌株中，24株(77.4%，24/31)存在rrs、eis和tlyA基因突變。4株非北京型菌株均發生rrs、tlyA基因突變。各耐藥基因在北京與非北京型間的突變情況差異無統計學意義。見表5。

表5 35株二線注射類藥物耐藥株不同基因型間基因突變情況[n(%)]

Tab.5 Distribution of different mutations of 35 resistant isolates among Beijing and non-Beijing genotypes

基因型rrseistlyAA1401GG1484TG(-10)AC(-14)T137位插入G無突變北京型(n=31)18(58.1)1(3.2)4(12.9)1(3.2)0(0.0)7(22.6)非北京型(n=4)3(75.0)0(0.0)0(0.0)0(0.0)1(25.0)0(0.0)P值①0.6351.000 1.000 1.000 0.1140.562

注：①Fisher確切概率法

3 討 論

二線注射類藥物是組成MDR-TB治療方案的重要藥物，其中，Km、Am屬于氨基糖苷類，Cm屬于多肽類藥物。已有研究表明，氨基糖苷類Km以及它的衍生物Am是通過修飾16S rRNA的核糖體小體結構抑制蛋白質合成，氨基糖苷類藥物耐藥的產生與16S rRNA編碼基因rrs突變相關[14-16]。本研究35株三種二線注射類藥物耐藥株中，21株(60%)發生rrs基因A1401G突變，突變頻率最高，與文獻[14-16]報道的一致。在21株A1401G突變株中，Cm呈現不同的MIC變化水平，Km、Am高水平耐藥株均明顯多于中低水平耐藥株，rrs基因A1401G突變與Km、Am高水平耐藥相關。此外，rrs基因A1401G突變是Km、Am和Cm發生交叉耐藥的分子基礎[14-17]。本研究重慶地區Km、Am和Cm耐藥菌株rrs基因突變率分別為64.7%、77.8%、73.7%，與敏感株有明顯統計學差異，故以rrs基因作為診斷標記物，應用于本地區二線注射類藥物的耐藥性檢測是可行的。

eis基因啟動子區突變提高了Eis蛋白表達水平，使氨基糖苷類藥物乙?；@著上升，加劇了耐藥性的產生[18]。本研究eis啟動子區突變率為14.3%(5/35)，分別低于泰國、法國及浙江和江蘇五區縣的17.2%、44.0%及26.4%[14,16,19]。4株eis啟動子區G(-10)A突變及1株C(-14)T突變株均為Km低水平耐藥，與文獻[18]報道的一致。泰國則報道eis啟動子區突變表現為Km高水平耐藥，可能為其他未知的耐藥機制與eis啟動子區突變同時發生[14]。eis基因啟動子區突變僅在Km耐藥與敏感表型間存在統計學差異，與Am、Cm耐藥關聯不大。由于eis基因啟動子區其較低的突變率，可與rrs基因聯合對Km耐藥性進行檢測。

雖然Cm屬于多肽類藥物，但其耐藥機制與氨基糖苷類藥物相似，除與編碼16S rRNA的rrs基因發生突變有關外，編碼2′-O-甲基轉移酶的tlyA基因突變是Cm耐藥性產生的重要原因，其突變導致rRNA無法被甲基化，核糖體功能受到影響而引起Cm耐藥[20]。本研究僅1株Cm耐藥株發生tlyA基因137位堿基插入改變，tlyA基因突變在Cm耐藥和敏感表型間無顯著差異，tlyA基因突變與Cm耐藥的關系還需進一步證實。雖然有若干文獻[14,17,20-21]報道tlyA基因突變涉及Cm耐藥，但由于其較低的突變頻率及突變類型的多樣性，用于分子快速檢測，tlyA基因并不是一個合適的靶標。

北京基因型菌株在重慶地區MDR-TB菌株中占83.0%，為本地區主要的流行株，與來自全國的數據一致[5]。各二線注射類藥物的耐藥性及耐藥基因突變情況在北京與非北京基因型間均無統計學差異，說明本地區二線注射類藥物耐藥與北京基因型并無相關性。

此外，需要引起注意的是有13株(5.7%，13/229)PCR測序與表型藥敏結果不一致。在35株注射類藥物耐藥株中7株(20.0%，7/35)未發現任何rrs、eis啟動子區和tlyA基因突變，提示細胞壁滲透性降低、藥物外排泵等其他耐藥機制的存在，也可能與異質性耐藥有關，即標本中敏感菌和耐藥菌并存，低比率的耐藥菌無法用分子藥敏方法檢出[22]。關于4株rrs基因突變及2株tlyA基因突變但表型敏感的菌株，其MIC水平多處于關鍵濃度值及其以下附近，可能與結果判讀、菌體活性、藥物濃度等操作因素或其他引起不準確因素有關。所以，分子藥敏試驗方法并不能完全取代表型藥敏方法，兩者可互為補充以提高對藥物敏感性結果的正確判讀，為MDR-TB患者化療方案的制定提供可靠依據。

利益沖突：無