甘肅地區宮頸鱗癌和腺癌患者人乳頭瘤病毒感染基因亞型分布研究

周慶云，石清芳，趙 潔，王東存，唐兆瑞

（甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050）

宮頸癌是嚴重威脅女性生命和健康的惡性腫瘤之一，發病率僅次于乳腺癌，死亡率在全球婦女癌癥中居第二位，在一些發展中國家甚至居首位。宮頸癌包括宮頸鱗癌和宮頸腺癌，宮頸腺癌較少見，但近年來其發病率明顯上升，與同期宮頸鱗癌相比預后更差。目前，已經明確高危型人乳頭瘤病毒（HPV）持續感染是宮頸癌的病因[1]，HPV16、18型與70%的浸潤性宮頸癌相關[2-3]。本研究通過檢測甘肅省內宮頸鱗癌及腺癌患者感染人乳頭瘤病毒（HPV）的基因亞型狀況，探討不同基因型HPV感染的致癌性，對本地區婦女宮頸癌早期發現和早期診治具有重要價值，為HPV疫苗開發研制提供科學依據。

1 對象與方法

1.1 對象

2014年11月至2018年5月甘肅省婦幼保健院婦科門診和住院，未經放療、化療，經病理組織學診斷為宮頸鱗癌患者377例，年齡26～79歲，平均年齡49.2歲，20～29歲7例、30～39歲 56例、40～49歲134例、50～59歲 119例、60～69歲 48例、70～79歲13例；宮頸腺癌患者39例，年齡30～65歲，平均年齡47.8歲，30～39歲6例、40～49歲19例、50～59歲9例、60～69歲5例?；颊呔鶠橐鸦閶D女，來自甘肅省內。取患者宮頸脫落細胞進行21種HPV亞型檢測。

1.2 儀器與試劑

HPV-DNA提取試劑盒，PCR擴增儀，Hybrimax醫用核酸分子快速雜交儀，人乳頭瘤病毒基因微陣列分型檢測試劑盒（均由香港凱普公司提供）。

1.3 標本采集與保存

窺陰器充分暴露宮頸，以棉拭子擦去宮頸口分泌物，用凱普公司配套專用宮頸刷置于宮頸口，順時針旋轉5周，慢慢抽出，以獲得足夠的移行區上皮細胞樣本，放入專用細胞保存液（3 ml）中，沿刷柄折痕處折斷，旋緊管蓋，做好樣本標記，立即送檢或放置4℃冰箱中，3天內檢驗。

1.4 檢測方法

HPV分型基因檢測步驟：（1）樣本DNA提?。喝颖?00 ul，以14 000 r離心一分鐘，棄上清液后，用凱普公司試劑盒提取DNA。（2）PCR擴增：將PCR反應試劑及Taq酶按比例混合后在反應管內加入 24 μl，再加入 DNA 模板 1 μl，混勻后進行PCR擴增。每批同時擴增HPV18型陽性對照及陰性對照各一份。（3）核酸分子快速導流雜交：采用Hybrimax醫用核酸分子快速導流雜交儀及配套試劑盒，在雜交平臺放入標記有21種HPV基因型寡核苷酸探針的低密度基因芯片雜交膜，按試劑盒說明進行導流雜交，酶標顯色。（4）結果判斷：肉眼觀察檢測結果，陽性點為清晰可見的藍紫色圓點，根據膜條HPV分型分布圖，判斷為何種HPV病毒類型。本檢測將HPV分為21種亞型，包括 15 種高危亞型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68 型，6 種低危亞型：6、11、42、43、44、81 型。有兩型或兩型以上者為多重感染。

1.5 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行分析，以百分率作為HPV感染的評價指標，HPV檢出率采用χ2檢驗，P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 宮頸鱗癌和腺癌患者HPV感染型別分布

377例宮頸鱗癌患者HPV總感染率為95.5%（360/377），共檢測到 17種 HPV 亞型，其中高危型 13種（16、58、18、33、31、52、39、68、51、53、45、56、59 型），低危型 4 種（81、44、42、43型），未檢測到 6、11、35、66 型。HPV16 型感染率最高，為76.7%，其次是58型（6.1%），見表1。39例宮頸腺癌患者HPV總感染率為48.7%（19/39），共檢測到6種HPV亞型，均為高危型單一感染，依次為 16型（47.4%），18型（26.3%），52型（10.5%）和58、51、45型（均為 5.3%），見表 2。

2.2 HPV單一感染和多重感染與宮頸鱗癌、腺癌的關系

本研究中，宮頸鱗癌HPV陽性患者共360例，單一感染319例，占88.6%，在多重感染的41例患者（11.4%）中，二重感染39例，占多重感染的95.1%，最常見的是HPV16型合并其他亞型感染，共37例，占90.2%；三重感染2例，其中1例是HPV16型合并其他亞型感染。單一感染率與多重感染率差異有顯著性（P<0.05），見表1。19例HPV陽性宮頸腺癌均為高危型單一感染，見表2。

3 討論

大量流行病學和分子生物學研究表明，HPV與宮頸癌及癌前病變密切相關[4]。現已發現兩百多種型別的HPV，根據其致病性分為高危型和低危型兩大類[5]，長期持續感染高危型可以致癌，危及患者生命。本研究中，宮頸鱗癌患者僅檢出4例感染低危型，且均與高危型HPV16型合并感染，宮頸腺癌患者中未檢出低危型，證實了只有感染高危型HPV才會引發宮頸癌的觀點。

3.1 宮頸鱗癌和腺癌患者HPV感染的差異

本研究中，宮頸鱗癌、腺癌的HPV總感染率分別為95.5%和48.7%。在一項針對西方國家的Meta分析中，HPV在宮頸鱗癌患者中的感染率為87.3%，在宮頸腺癌患者中的感染率為76.4%[6]。在我國，宮頸鱗癌患者HPV感染率超過80%，而在宮頸腺癌患者中的感染率達50%～70%[7-8]。相比之下，甘肅地區宮頸鱗癌患者的HPV總感染率偏高，而腺癌患者的HPV總感染率偏低，這或許與樣本數量較少有關，還需今后進一步研究。

3.2 宮頸鱗癌和腺癌患者主要感染的HPV亞型存在地理差異

最新的亞洲婦女宮頸癌中HPV常見亞型報告顯示[9]，無論在西亞還是東亞，HPV16型和HPV18型都是感染率最高的兩個型別，而其他HPV感染型別排序有所差異。在西亞地區，HPV45、33、31、35、58、52、56 型和 59 型為繼 HPV16、18 型后最常見的 8 種型別，而在東亞地區則為 58、33、52、45、31、59、39、35型。本研究顯示，宮頸鱗癌患者感染了17種HPV亞型，如HPV16、58、18、33、31、52、39、68、51、53 型等，主要感染亞型與文獻報道基本一致。喻朝霞等[10]報道，南方地區宮頸鱗癌患者HPV 主要感染亞型依次為 16、18、33、58、31、52、59、45 型；陶萍萍等[11]報道北京宮頸癌患者HPV主要感染亞型依次為16、18、52、58、33型。說明我國南、北方地區宮頸癌患者主要感染的HPV亞型存在一致性，但也存在地理差異。本次研究中宮頸鱗癌患者主要感染的為HPV16、58型，與國內研究結果有一定差異，值得重視。文獻報道宮頸腺癌主要感染亞型為16、18、39型[7]或 16、18、31、33、52、58 型[12]。本研究中宮頸腺癌 HPV 主要感染16、18、52、58、51、45 型，主要型別相同，16、18 型之后排序有一定差異，這可能與地域、種族和樣本量不同有關。

3.3 單一感染較多重感染更有可能增加宮頸鱗癌和腺癌發生率

對于HPV多重感染是否會促使宮頸癌發生，目前研究觀點尚不一致。有學者認為多重感染并不增加宮頸癌發生率[4]，但也有學者認為多重感染促使宮頸癌發生，并使治療更加棘手[13]。本研究中，宮頸鱗癌HPV單一感染和多重感染比為7.8∶1，單一感染率明顯高于多重感染率，在宮頸鱗癌HPV感染主要型別方面單一感染與多重感染相比差異有顯著性（P<0.05）。國內報道宮頸腺癌均檢出多重感染[12]，或以多重感染為主、單一感染為輔[14]。本研究中，宮頸腺癌均為單一感染，與文獻有較大差異。在一定程度上說明單一感染對宮頸鱗癌和腺癌的發生發展起到促進作用，但其具體作用機制仍需要進一步研究。

研究資料表明，由于清除率低，HPV16型感染可能更易導致持續性感染[15]。本研究中，宮頸鱗癌、腺癌中HPV16型單一感染占首位，感染率達76.7%和47.4%，表明甘肅地區HPV16型單一感染可能是宮頸鱗癌和腺癌的主要原因。因此，對于HPV感染者不僅要重視其是否已經出現宮頸病變，積極進行臨床治療，還要重視其所感染的具體亞型，特別是對HPV16型感染者應密切隨診，以便及早發現異常、盡早干預，有效降低宮頸癌發生率。

總之，宮頸鱗癌和宮頸腺癌在流行病學、生物學行為、轉移復發模式、生存率以及對治療的反應等方面均有不同，與同期宮頸鱗癌相比，宮頸腺癌預后更差。宮頸腺癌的發生與HPV感染密切相關，研究其致癌機制對臨床診治意義重大。我國地域遼闊，不同地區及民族宮頸鱗癌、腺癌的主要感染亞型不盡相同。明確一個地區HPV致癌的主要型別，根據感染型別預測病變進展，評估預后，對于指導臨床醫生確定診治方案，避免過度治療具有重要意義，同時能為研制適合本地區的HPV疫苗提供流行病學資料。