巴氏殺菌乳風味品質及殘留微生物測定研究進展

楊姍姍，丁瑞雪，劉語萌，孫雪婷，岳喜慶，武俊瑞*

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

牛乳因其營養成分豐富且比例適合、營養成分吸收率高等特點，被公認為理想的營養食品[1-2]。隨著生活質量的提高，人們對于乳品的需求出現逐年上升趨勢。與其他殺菌方法相比，巴氏殺菌既能有效地殺死牛乳中的致病菌，又能很好地保留有益人體的各種營養物質[3-4]，因此巴氏殺菌乳深受消費者青睞。

隨著風味檢測技術及高通量測序技術的快速發展，這些技術越來越多地應用到乳品領域。與傳統風味檢測技術相比，電子鼻、電子舌、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）等新型測定方法不僅可以快速分離出樣品中的化合物信號，同時還可以通過保留指數定性給出許多未知化合物的風味信息，有利于進一步對其性質進行深入探討和研究[5]。

近年來，下一代測序技術克服了傳統微生物純培養方式的弊端，能夠更加準確地監測、鑒定食品中的微生物[6-10]，因此能夠為預防食品腐敗變質提供新的思路[11-15]。本文對近年來國內外的相關最新研究成果進行歸納與總結，以期為業內科研人員提供具有參考價值和理論依據的相關信息。

1 巴氏殺菌乳概述

巴氏殺菌乳具有營養價值高、風味品質好等特點。因其熱處理方法溫和，營養與風味物質得到較好地保留，在國內外快速地發展起來并得到廣大消費者的認可[16]。

起初，巴氏殺菌的溫度-時間組合選擇基于熱處理量，稍有不慎，就會導致牛乳中未被殺死的致病菌在人體中成為病原體。1986年，國際乳制品聯合會把巴氏殺菌定義為“一種應用于產品的過程，通過熱處理盡可能使產生的有害微生物及危害人體健康的理化性質最小化”[17]。1987年，美國食品藥品監督管理局公布了專供人食用的乳制品強制巴氏殺菌法[18-20]。

2 巴氏殺菌乳中營養指標測定的研究進展

2.1 巴氏殺菌乳中營養成分的測定

巴氏殺菌乳中蛋白質、脂肪、乳糖、非脂乳固體（solids-not-fat，SNF）等基本營養指標的測定，目前應用較多的是凱氏定氮法、索氏提取法等常規檢測方法，但由于這些方法過于耗時、繁瑣，乳品營養成分快速測定分析儀便應運而生。乳品分析儀可以迅速檢測牛乳中蛋白質、SNF、脂肪、冰點、密度等多個指標，是乳品企業生產中必備的一種快速檢測儀器。

2.1.1 巴氏殺菌乳中蛋白質及氨基酸含量的測定

目前，測定食品中蛋白質的含量需根據GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》[21]。此標準中有3 種方法，第1種是凱氏定氮法，是檢測蛋白質運用極為普遍的方法；第2種是分光光度法，該法具有選擇性高、穩定性強等特點，并且1 次可以檢測多個樣品；第3種方法是燃燒法，僅適合蛋白質含量10%以上的樣品測定[22-23]。對于乳中蛋白質含量的測定，前2 種方法較為多見。近年來，乳品企業生產逐步采用乳品快速分析儀來迅速檢測牛乳中的蛋白質、SNF、脂肪、冰點、密度等多個指標。孫雪姣[24]已利用乳品分析儀對不同貯藏條件下巴氏殺菌乳中的營養成分進行測定，結果精確，耗時少，可以進行批量檢測。

隨著相關研究的深入，對小分子的研究也逐漸升溫，蛋白質通過蛋白酶代謝產生的氨基酸含量測定方法也逐步發展起來。國內外氨基酸的測定方法越來越多，主要有高效液相色譜法[25]和比色法[26]，這2 種方法1 次僅能檢測1 種氨基酸，耗時很長，儀器穩定性較差，適合小樣本，無法滿足大規模的實驗研究。近年來，全自動氨基酸分析法的發明解決了上述一系列問題，如今已被廣泛使用[27-28]。丁瑞雪[29]利用該方法對不同殺菌條件下巴氏殺菌乳的氨基酸含量進行測定，發現該法測定速率快、實用、方便。研究還發現，乳中的游離氨基酸會影響乳的營養品質，而且牛乳的吸收也是人體必需氨基酸的主要攝入方式。目前，GB/T 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》中對乳品樣本中氨基酸的檢測均采用此方法[30-31]。游離氨基酸的測定結果對人體的影響也有了最新的認識[32-33]。研究表明，人初乳中的游離氨基酸含量高于牛乳[34]，原料乳中游離氨基酸的含量、組成也受到牛乳種類、熱處理等方面的影響[33]。

2.1.2 巴氏殺菌乳中脂肪及脂肪酸含量的測定

脂肪含量高低是評價乳品品質優劣的重要指標，俗稱“以脂論價”。因此，研究者為了能夠快速、準確地測定乳中脂肪含量，研究了許多測定方法，包括哥特里羅紫法、分光光度法、離心分離法及蓋勃氏法等。其中，哥特里羅紫法是目前GB/T 5009.46—2003《乳與乳制品衛生標準的分析方法》中推薦使用的方法，該方法的穩定性較好，因而被廣泛使用，但該方法不適用于酸乳中脂肪的測定[35]。

脂肪酸的種類與適合的比例對維持人體健康具有重要意義。隨著相關研究工作的開展，該方面的儀器研發也不斷改進，傳統的乙醛抽取法、離心分離法已不再能滿足如今的實驗需求，原子吸收分光光度法、氣相分析法也已成為過去[36-38]。研究表明，采用氣相色譜法對脂肪酸進行分析時存在諸多弊端，例如，長碳鏈的酯不易被氣化、以三氟化硼的甲醇溶液進行酯化反應時易發生熱降解、同分異構化和雙鏈遷移等現象，原因是不飽和脂肪酸酯在受熱時性質不夠穩定；高效液相色譜法適用于分離熱不穩定性化合物，很多報道用其分離分析脂肪酸，該方法迅速簡便，結果精確可靠[39-42]。研究表明，牛乳中長鏈飽和脂肪酸含量普遍很高，但攝入過多的飽和脂肪酸會對健康產生不利影響[43-45]。近些年來，GC-MS技術的應用為更好地鑒定巴氏殺菌乳的加工工藝條件提供了理論依據[45-47]。林觀平等[48]曾在湖光牛乳脂肪酸的GC-MS分析過程中發現，牛乳中飽和脂肪酸含量較高，多不飽和脂肪酸含量則很低。張宇等[49]在對母乳及山羊乳的研究中發現，母乳中主要功能性脂肪酸含量明顯高于山羊乳，脂肪酸組成極為豐富。研究表明，牛乳、羊乳等原料乳經過加工后制成品種多樣的乳制品，能夠提高短鏈飽和脂肪酸含量，更利于人體健康，不僅增加了其經濟價值，更大幅度提高了乳制品的營養利用率[50-51]。

2.2 巴氏殺菌乳感官品質及味感的測定

巴氏殺菌乳的感官檢驗從乳品的滋氣味、色澤及組織狀態3 個方面進行評價。依據RHB101—2004《巴氏殺菌乳感官質量評鑒細則》，通過感官分析培訓的人員對巴氏殺菌乳的組織狀態、滋氣味和色澤進行感官評鑒。進而對所得到的數據進行整理分析，獲得巴氏殺菌乳的感官評鑒分數。然而，人為感官鑒評中客觀因素很多，近些年此方法逐漸被新方法所替代[24]。

電子舌是一種液體味道的新型檢測方法[52]，現已廣泛應用于乳制品檢測中。叢艷君等[53]使用電子舌對6 種固化酸乳進行分類。吳進菊等[54]也利用電子舌對市場上采用發酵劑制作的酸乳進行滋味品質的測定，結果表明，樣品間酸度差異最大，其次是咸味，其余指標差異相對較小。隨著巴氏殺菌條件的改變，酸味味感值變化極為明顯，這表明滅菌過程也是控制牛乳質量的重要因素。

目前，電子舌重點應用于不同品牌牛乳的質量檢測，對樣品的味道特征進行綜合評價[55-58]。Toko等[59]首先將電子舌技術應用于牛乳分析，利用偏最小二乘回歸模型、主成分分析等分析方法驗證了電子舌可以較好地區別不同貯藏時間、不同熱處理工藝及不同貯藏溫度下的牛乳。Dias等[60]將電子舌技術用于鑒別羊乳中摻雜的牛乳。Sim等[61]評估巴氏殺菌乳和超高溫加熱處理（ultra-hightemperature，UHT）乳2 種商品乳的質量，發現電子舌能夠較好地反映不同貯藏時間內牛乳的質量變化。

2.3 巴氏殺菌乳風味及氣味的測定

對于牛乳風味品質的研究很早就已經開始，但限于當時的技術和儀器發展水平，風味的初步評價還是由專業評估人員進行。隨著深加工生產的出現，新型儀器的重要性逐漸顯現。

電子鼻是能夠處理樣品中揮發性成分相關信息的一種新技術[62]。電子鼻在牛乳中的重點應用包括品質識別[63]、摻假分析[64-65]、風味特征分析[66-69]及污染情況評定[70-73]等方面。采用聚類分析法和電子鼻傳感器分析法對保質期內巴氏殺菌乳的感官品質穩定性進行分析和評定，研究表明，電子鼻對樣品整體風味的區分和識別效果良好，樣品與第2主成分的負相關性增強，保質期內的巴氏殺菌乳風味顯示出較為明顯的差異[74]。宋慧敏等[75]利用電子舌和電子鼻對不同熱處理牛乳的風味品質進行測定，通過判別因子法和主成分分析法對測定結果進行處理和分析，結果表明，熱處理方式對牛乳的風味品質影響較大，并且，牛乳的風味品質與熱處理程度具有一定的相關性。將2 種技術結合起來能很好地區分牛乳的熱處理程度，并且能對牛乳的加熱程度進行大致判斷。

乳制品的風味是影響貨架期、消費者接受度和其他屬性的重要參數[76]。液態原料乳極易受到影響，因其中存在耐熱酶及多種微生物[77]，當利用熱處理工藝來破壞微生物負荷及酶活性時，牛乳風味將會不同于原料乳[69]。在經典的風味分析中，根據不同的提取方法（頂空萃取分離、固相微萃取、動態頂空萃取和攪拌棒吸附萃?。┓治龊蜏y定牛乳中的香味物質[78-81]是揮發性物質測定的主要步驟。揮發性化合物是食品風味香氣的重要來源，但僅有一小部分存在于食品中的揮發性化合物擁有風味活性，并對風味有所貢獻[82]。Olmedilla等[83]研究發現，利用氣相色譜法在熱處理牛乳中共發現5 類重要的揮發性物質，分別為酮類、硫化物、醛類、苯環類和蒽醌類。Licón等[84]研究發現，酮類是許多牛乳中的標志性揮發性風味物質。近期的研究表明，GC-MS檢測發現，醛類物質是牛乳風味和乳脂氧化反應的共同特征產物[85-86]。丁瑞雪[29]也利用GC-MS方法對不同殺菌條件下巴氏殺菌乳的揮發性風味物質進行測定，此方法操作簡便，共檢測出21 種風味物質，能夠較好地判斷不同殺菌條件下巴氏殺菌乳中揮發性風味物質的變化情況。

3 巴氏殺菌乳中微生物群落的研究進展

3.1 微生物純培養技術

微生物在牛乳的腐敗變質過程中起到至關重要的作用，人們從巴斯德時期就認識到了這一點。數百年來，學者們研究出許多檢驗牛乳中微生物的方法，如標準平板計數法、美蘭還原酶實驗法、顯微鏡鏡檢計數法等，均以傳統的微生物純培養技術為基礎。研究發現，自然界中的絕大部分微生物屬于未培養和不可培養的微生物，不能采用傳統的培養方式進行分離、培養[87]。此外，現有條件無法滿足許多微生物生長所需。菌落總數一直以來是被用于評價牛乳中微生物的主要指標，但是菌落總數也僅是數量上的統計，無法鑒別牛乳中微生物的種類。因此該方法存在很多不足，牛乳的菌落總數并不能完全反映牛乳中的微生物狀況。

3.2 聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術

利用不同濃度的尿素和甲酰胺配制聚丙烯酰胺凝膠進行實驗，可以使不同序列的DNA被分開[88]。和其他方法相比，PCR-DGGE的優越之處是不需進行微生物純培養，既能縮短實驗時間，又能把樣品中未培養和不可培養微生物的遺傳物質鑒定出來。例如，趙亮等[89]采用PCR-DGGE技術研究白酒中的微生物群落組成；王穩航等[90]采用PCR-DGGE技術研究發酵肉制品的菌群組成。

3.3 PCR-溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）技術

PCR-TGGE與PCR-DGGE的基本原理相似，但是2 種方法的變量不同，PCR-TGGE不會改變凝膠中尿素、甲酰胺的濃度，而是改變溫度。電泳在凝膠金屬板上進行，金屬板上的溫度梯度凝膠可以對來自同一PCR產物的不同DNA片段進行高效分離。與PCR-DGGE技術相比，PCR-TGGE技術因其凝膠膠體小、操作簡便，更節省時間，實驗結果的重現性更高。顧采東[91]在分析不同熱處理方法對牛乳殺菌效果的影響時利用了PCR-TGGE技術。

3.4 高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術

HTS技術亦稱為“下一代”測序技術[11,92]，可以同時高效測序從多個樣品中提取的DNA。一系列分子水平測序方法，如基因組測序已被廣泛應用[93-94]。

最近已有相關研究人員采用HTS技術描述乳制品中的微生物群體，并且已經證明HTS技術的采用大大增加了測序通量，豐富了實驗分析中的信息量，同時提供微生物多樣性的綜合分析[95]。Aldrete-Tapia等[96]通過HTS技術研究手工干酪的細菌菌群多樣性和群落結構。HTS技術的應用在理解乳制品中細菌群落的多樣性方面取得了快速進展。

為測定原料乳中微生物區系的分布，于國萍等[97]利用HTS技術對14 個奶牛場的原料乳進行了序列測定，以測定微生物區系的多樣性和病原菌的分布，結果發現，不同牧場原料乳的菌群存在多樣性，并且個體養牛場的原料乳中也存在金黃色葡萄球菌和志賀氏菌，還時常檢測到一些不太豐富的雙歧桿菌科和莫拉氏菌科。瑪依樂·艾海提等[98]利用HTS技術對南疆傳統發酵酸乳中的微生物群落多樣性進行鑒定和分析，結果表明，各組樣品間的微生物在數量和種類上存在明顯差異。李盈盈[99]在研究某品牌乳粉加工過程中不同階段的微生物多樣性時采用了HTS技術，結果表明，原料乳階段的物種豐度、操作分類單元數量和種群結構多樣性均低于其他3 個加工階段（濕混乳、濃縮乳、乳粉），進而可以得出結論，在乳粉加工過程中應密切關注其微生物多樣性的變化，這對于避免乳粉的微生物污染具有重要意義。

4 結 語

隨著現代風味檢測技術在乳品行業的推廣，與UHT乳相比，巴氏殺菌乳在感官品質上的優勢逐漸凸顯。HTS技術的應用使得以前從未在巴氏殺菌乳中被檢測出的微生物被發現，這對于提高巴氏殺菌乳感官品質、優化巴氏殺菌乳生產工藝和延長巴氏殺菌乳貨架期具有重要的指導意義。同時，巴氏殺菌乳風味品質與其中殘留微生物的相互關系值得進一步研究。