諾如病毒的致病機制及診斷

周弘璐，譚明，汪萱怡,4

1. 復旦大學上海醫學院基礎醫學院教育部、衛健委、醫科院醫學分子病毒學重點實驗室，上海 200032； 2. 辛辛那提兒童醫院醫學中心傳染病室，辛辛那提，俄亥俄州，美國; 3. 辛辛那提大學醫學院兒科系，辛辛那提，俄亥俄州，美國; 4. 復旦大學附屬兒科醫院，上海 201102

感染性腹瀉為國際上公認的5歲以下兒童第2位死因[1]。隨著社會經濟的發展和衛生條件及飲水設施的改善，細菌和寄生蟲感染得以控制，感染性腹瀉的病原逐漸以病毒為主。由于輪狀病毒(rotavirus,RV)疫苗的推廣，諾如病毒(norovirus, NoV)已取代RV成為病毒性急性胃腸炎的第一病原體，并因此越來越引起全球的關注[2]。NoV是引起全人群急性胃腸炎(acute gastroenteritis, AGE)流行和暴發的主要病原體，也是引起食源性疾病的最常見非細菌性病原體[3]。NoV主要以糞-口途徑傳播，平均潛伏期為12～48 h，典型癥狀包括嘔吐(≥50%的病例)、腹瀉、惡心、腹部絞痛、肌肉痛、低熱等，持續2～3 d，具有良好的自限性。但在<5歲兒童、>60歲老年人以及免疫功能缺陷患者中可引起嚴重的疾病，導致脫水、休克甚至死亡[4]。

1 NoV的病毒學特性

NoV屬于杯狀病毒科NoV屬，為單股正鏈的小RNA病毒，無包膜，直徑為27～40 nm，呈二十面體對稱球形。基因組全長約7.7 kb，包含3個開放讀碼框(open reading frame, ORF)ORF1、ORF2和ORF3[5]。ORF1編碼1個多聚蛋白，翻譯后裂解成為6種非結構蛋白(non-structure protein，NS)，在病毒復制中起重要作用。ORF2和ORF3分別編碼主要結構蛋白(major structural protein，VP1)和次要結構蛋白(minor structural protein，VP2)。X線晶體結構分析顯示，衣殼蛋白VP1包含兩大結構域，分別是殼區(shell 或 S domain)和突起結構域(protruding 或 P domain)，后者可進一步分為提高病毒穩定性的P1亞結構域和高度可變的P2亞結構域，P區和S區通過柔性的鉸鏈區連接，高變的P2區決定病毒的抗原性，但位于P2區的受體結合部位相對保守，與宿主受體結合，啟動感染。成熟的病毒顆粒包含180個VP1蛋白，組成90個二聚體，形成二十面體對稱結構。早期依賴電鏡方法對病毒進行描述區分，NoV在電鏡下顯示杯狀結構(cup-like structure)，故稱杯狀病毒。最近研究表明，NoV和宿主受體結合后，杯狀病毒的次要衣殼蛋白VP2形成一穿透衣殼的特殊通道，幫助NoV釋放基因組RNA到宿主細胞[6]。

NoV宿主廣泛，可感染人類、嚙齒動物、貓科動物、犬科動物、海獅、豬、綿羊、牛、蝙蝠等。NoV具有高度的基因多態性，根據VP1蛋白序列及其編碼的序列不同，可將其分為7個基因組(GⅠ～Ⅶ)，其中GⅠ、GⅡ和GⅣ能感染人類并致病，所以又稱人源諾如病毒 (human norovirus, HuNoV)，至少包括30種以上的基因型，其中GⅡ.4是造成全球NoV暴發和流行的主要基因型[7]。但在2014―2015年冬季，日本和中國上海、北京、浙江、江蘇、廣東等東亞地區都相繼出現新型GⅡ.17，成為AGE暴發的主導毒株[8]。此外，2016年10―12月，中國NoV病例暴發數與前4年同期相比大幅增加，79%由重組株GⅡ.P16-GⅡ.2引起[9]。

2 感染及致病機制

HuNoV尚未能常規培養，而且缺乏有效的動物疾病模型，因此對HuNoV的感染及致病機制仍未十分了解。目前HuNoV感染及致病數據主要來源于志愿者攻毒試驗，志愿者攻毒試驗對HuNoV感染后發病機制的研究具有重要意義，但實踐中受許多因素的限制，如不能針對特定基因缺陷的個體，獲取感染時的組織樣本也頗受限制。因此，考慮到基因和環境因素的可操作性，動物感染模型多應用于NoV與宿主間相互作用的研究，如無菌豬、無菌牛、黑猩猩、免疫缺陷小鼠等。其中應用最廣泛的為鼠諾如病毒(murine norovirus, MuNoV)感染系統。

2.1 NoV的細胞嗜性

近年來，體內、外研究顯示NoV對免疫細胞和腸上皮細胞(enterocyte)具有感染性。在體外細胞培養試驗中，MuNoV能感染巨噬細胞、樹突細胞和B細胞[10-11]；而HuNoV能低程度感染B細胞[12]，卻不能感染巨噬細胞和樹突細胞[13]，可見HuNoV與MuNoV的細胞嗜性不盡相同。更加有趣的是，無論是HuNoV還是MuNoV，在B細胞中復制都不會造成明顯的細胞病變效應(cytopathic effect, CPE)，而在巨噬細胞和樹突細胞中復制則會引起細胞裂解。與此發現相一致的是，MuNoV能在B細胞卻不能在巨噬細胞和樹突細胞中持續感染[14]。這些現象令人頗為驚訝，因為有包膜的病毒可以通過出芽的方式從細胞內釋放，而NoV作為無包膜的病毒理論上需裂解細胞才能釋放出后代病毒顆粒。

作為感染腸道、引起腹瀉的HuNoV，它們的靶細胞一直被認為是腸上皮細胞，這些假設已在早期的人體攻毒實驗和活組織檢查(biopsy)中[15]得到初步證實。與此類似，在HuNoV感染無菌牛和無菌豬的腸組織中，檢測到NoV陽性的腸上皮細胞[16-17]。此外，Ettayebi等[18]在體外干細胞來源的人類類腸細胞中成功復制HuNoV，進一步證實腸上皮細胞是HuNoV的宿主細胞。最近，Wilen等[19]發現一種罕見的腸上皮細胞——叢細胞(tuft cell)，它能表達CD300If，是小鼠腸道MuNoV的靶細胞，且2型細胞因子通過誘導叢細胞增殖促進MuNoV感染。需要指出的是，盡管NoV能感染腸上皮細胞和免疫細胞，而且基于腸上皮細胞和免疫B細胞的HuNoV培養系統[12, 18]已被建立，但其培養條件苛刻、復雜且隨基因型變化，導致HuNoV復制效率低下，難以用于中和抗體檢測。所以NoV的體外培養仍是細胞嗜性研究中的一大挑戰。

病毒感染需要跨越腸上皮屏障，轉移至下層免疫細胞，進而有效誘導免疫和炎癥反應。在這個過程中，一種特化的腸上皮細胞——M細胞發揮了重要作用。M細胞位于腸腔的派爾集合(Peyer’s patches)淋巴結并散布在淋巴濾泡中，雖然其頂端表面缺乏微絨毛，也不分泌黏液，但能選擇性攝取和轉運抗原至下層免疫細胞[20]。很多病原體能利用M細胞跨越腸上皮屏障，如依賴CXCR4受體蛋白的嗜淋巴細胞(X4)可與M細胞上的CXCR4受體結合，穿過上皮細胞[21]。研究顯示，NoV也可利用M細胞穿過腸上皮屏障。首先，即使在沒有病毒復制和破壞腸上皮細胞完整性的情況下，M細胞也能介導HuNoV和MuNoV通過極化的單層腸上皮細胞，在頂部內化，然后在基底部釋放，釋放的病毒仍能有效地感染基室內潛在的免疫細胞[22]。M細胞表達的特異性表面蛋白受體如b1整合素和糖蛋白2可能有助于病毒顆粒的黏附而協助感染活動[23]。此外，Gonzalez-Hernandez等[22]發現在M細胞缺失的小鼠中，兩種不同的MuNoV毒株復制均減少，但僅為減少而不是完全消失，這表明存在額外的病毒攝取途徑，可穿過腸上皮屏障。無論如何，這些結果直接或間接地支持了NoV利用M細胞跨越屏障并感染免疫細胞的假說。

2.2 NoV受體或附著因子及個體易感染性

腸上皮表面的組織血型抗原(histo-blood group antigens，HBGA)被認為是NoV的宿主受體或附著因子[24]，與HBGA的相互作用使得NoV得以附著宿主細胞，啟動病毒感染。HBGA是一類含巖藻糖的復合糖類，除了分布在紅細胞表面，還廣泛分布在呼吸道、泌尿生殖道和消化道黏膜細胞表面，也可以游離寡聚糖的形式存在于生物體液中，如唾液、腸液、乳汁和血液[25]。HBGA包括常見的H/A/B抗原(對應O/A/B血型)，以及Lea、Leb、Lex、Ley抗原(對應Lewis血型)。H/A/B抗原分別在HBGA前體的基礎上由對應的糖基轉移酶(分別叫FUT2、A酶和B酶)催化形成，Lewis血型則由FUT3酶催化產生。不同HBGA表型的個體與NoV結合能力不同。有研究顯示，有些NoV，比如諾瓦克病毒GI.1，與H/A抗原的結合能力高于B抗原[26]；使得O表型的個體相對于B表型的個體更容易被諾瓦克病毒感染[27]。

FUT2基因編碼α(1,2)-巖藻糖基轉移酶，該糖基轉移酶可在HBGA前體上加上一個α(1,2)-巖藻糖，使之成為ABO抗原的前體H抗原。具備FUT2基因和FUT2酶活性的個體，被稱為“分泌型”(secretor)；約有20%的個體因FUT2基因突變導致FUT2酶失活，從而不能表達ABO抗原，被稱為“非分泌型”(non-secretor)。在歐美國家，FUT2基因的428 (G→A)純合無義突變最常見，該突變導致無法合成H抗原，所以這些個體被稱為非分泌型；而在亞洲國家，FUT2基因的385 (A→T)錯義突變更普遍，突變后仍可表達低水平的H抗原，這些個體常被稱為“弱分泌型”[28]。

分泌型個體對大多數NoV，尤其是常見的 GⅡ.4 NoV易感，而非分泌型個體對大部分NoV耐受，所以NoV感染有基因型特異性，其中基因型GⅠ.1和GⅡ.4表現尤為顯著[29]。然而在分泌型個體中，也有部分抵抗NoV感染，說明HBGA基因遺傳的差異并不能完全解釋NoV的易感性，免疫記憶或其他一些未知的因素也可能對NoV感染提供保護作用。此外，研究顯示非分泌型個體也對特定基因型的NoV敏感[30-31]。比如，Shirato等發現GⅠ.2、GⅠ.3、GⅠ.4、GⅠ.8、GⅡ.4和GⅡ.7能夠與Lea抗原(非分泌型個體特有的血型抗原)結合；在瑞典GⅠ.3 NoV暴發調查中發現，不同表型的個體之間發病情況沒有明顯差異，且GⅠ.3也能和Lea抗原結合[30]；分別由GⅡ.3和GⅡ.4引起的胃腸炎暴發事件中，都出現了非分泌型個體發病的情況。這些研究結果的差異也可能由于地區、種族、毒株變異等不同引起。因此，NoV的易感和耐受機制需要進一步探索和驗證，尤其是那些文獻中不曾記載的基因型。早期研究表明，HBGA結合位點在P區結構域內[32]，進一步通過P區結構域和HBGA寡聚糖共結晶及X-射線分析[33]顯示，HBGA結合位點位于NoV突出區結構域的頂端(P2區)，即病毒的最外端。該位點屬于構象型結構(conformational structure)，由數個不連續的氨基酸構成。HBGA結合位點在GⅠ和GⅡ基因組(genogroup)內各自保守。總體而言，它們大致可分為兩大區域，分別是中心部位的保守區和周圍的高變區[25, 34-35]。中心保守區為NoV感染宿主關鍵處，即為病毒存活所必須，而高變區對NoV進化及擴展易感人群具有重要意義。

2.3 腸道共生菌對NoV感染的影響

腸道共生菌在調節病毒感染方面也發揮了重要作用。Jones等[11]通過HuNoV感染B細胞系的體外試驗發現，腸道共生菌表面表達的人類HBGA受體能夠促進NoV感染B細胞。此外，腸道菌群可能通過抑制誘導IFN-λ信號，直接或間接促進病毒復制[36]。而利用抗生素消耗小鼠腸道內微生物群后發現，MuNoV的復制水平降低，從側面印證了腸道共生菌能夠促進NoV感染[37]。相反，Lei等[38]通過HuNoV感染無菌豬的體內試驗發現，腸道共生菌(E.cloacae)會抑制HuNoV感染，病毒顆粒脫落減少，腸道組織中的病毒滴度降低，且沒有在B細胞中觀察到HuNoV感染。與此類似，Lee等[39]利用RAW264.7細胞系體外驗證了乳桿菌(Lactobacillus)抗MuNoV感染的作用。由此看來，腸道共生菌對于HuNoV或MuNoV感染的作用并沒有很好的一致性，可能受到體內和體外試驗條件、實驗動物模型、感染細胞系種類等多種因素的潛在影響，這些問題有待將來的研究澄清。

2.4 NoV感染導致的病理學變化

在HuNoV攻毒試驗中，給予志愿者諾瓦克病毒(Norwalk; GⅠ.1)或夏威夷病毒 (Hawaii; GⅡ.1)后取其近端小腸活檢標本。鏡檢顯示，腸絨毛鈍化變寬，微絨毛縮短，線粒體變大，隱窩細胞增生，胞質空泡形成，多核和單核細胞滲入固有層，表現出輕微的炎癥浸潤。雖然NoV感染志愿者顯現腸上皮細胞異常，但細胞和黏膜卻保持完整狀態[15, 40-41]， 胃底和胃竇內未見組織學改變[42]。小腸刷狀緣酶活性(堿性磷酸酶、蔗糖酶和海藻糖酶)下降，造成輕度脂肪痢和短暫碳水化合物吸收不良[43]。空腸腺苷酸環化酶活性并沒有升高，胃酸、胃蛋白酶的分泌以及其他內在因素可能與這些組織學改變有關。而胃排空延遲、胃動力減弱可能與胃腸炎的惡心、嘔吐癥狀有關[44]。總體而言，由于缺乏有效的NoV感染致病動物模型，由HuNoV感染引起的AGE的致病機制目前還不是很清楚，有待進一步研究來解釋。

3 NoV感染的診斷學

雖然在直腸拭子和嘔吐物中都可以檢測到NoV，但糞便中病毒含量相對較高，故將其作為臨床首選標本。在1990年NoV基因組成功克隆和測序之前[45]，電子顯微鏡(electron microscopy, EM)是檢測病毒的唯一方式。根據第1批病毒的收集地點和EM觀察到的形態學結構，將其命名為諾瓦克樣(美國俄亥俄州諾瓦克鎮)病毒或小圓結構病毒(small round structural virus)，現正式命名為諾如病毒。由于EM觀察的NoV分辨率低，不易與其他胃腸炎病毒區分，而且該方法耗時、昂貴，不適宜在日常診斷中使用。此外，由于NoV基因型和抗原性的多樣性以及抗原漂移的存在，對酶免疫試驗(enzyme immunoassay, EIA)試劑盒的研發及應用構成困難和挑戰。

3.1 分子生物學診斷

20世紀90年代，開發了第1個針對NoV ORF1區聚合酶基因(region A)的傳統反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)[46]。隨著可利用序列的增加，RT-PCR方法被不斷優化，特別是改善引物設計使其具有廣譜反應性，現能檢測絕大部分的NoV流行株[47]。NoV廣譜RT-PCR的關鍵就是找到可用作PCR引物的保守序列，擴增特定區域后可用于測序、分型。這些區域包括編碼聚合酶的基因(region A和B)以及編碼衣殼蛋白的基因(region C、D和E)，其中最常用的是region A和region C，比較多聚酶和衣殼序列可判斷毒株是否重組[47]。《諾如病毒感染暴發調查和預防控制技術指南》(2015版)方案推薦利用衣殼蛋白的部分區域(region C)來對NoV進行分型，引物G1SKF、G1SKR和CoG2F、G2SKR分別用于GⅠ和GⅡ的檢測[48]。

與傳統的RT-PCR相比，實時定量反轉錄聚合酶鏈反應(real-time RT-quantitative PCR assays, RT-qPCR)具有更高的靈敏度和特異度，使用熒光標記的寡核苷酸探針，不需要瓊脂糖凝膠電泳分析。一步法RT-qPCR試驗中，反轉錄和cDNA擴增在一個反應中進行，樣品處理更加簡單，降低了交叉污染的風險，更適合于臨床實驗室檢測。雖然目前很多PCR針對病毒的聚合酶基因，但序列分析顯示ORF1-ORF2連接處的保守區域也可作為引物和探針設計[49]。盡管美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)還沒有批準商業化NoV RT-qPCR檢測試劑盒，但該方法顯然已經成為NoV檢測的金標準，用于檢測糞便、嘔吐物、血清、食物、水等多種形式的標本。而且，RT-qPCR設有內部質控，可以減少假陰性結果，并能同步檢測GⅠ、GⅡ和GⅣ株[50-51]。同時，RT-qPCR可以半定量方式測定樣本中的病毒載量。研究顯示，病毒載量高的患者病毒脫落時間更長，通常GⅡ基因組的糞便病毒載量高于GⅠ組[52]。但是，RT-qPCR分析靈敏度高，可以檢測到含量極低的病毒，無癥狀的感染者或幾周前感染現已恢復的個體中仍可能檢測到NoV，因此，若癥狀發作后超過3～5 d收集樣品并具有高循環閾值(即低病毒載量)，應謹慎分析，以確定AGE的病因。

3.2 多病原體檢測平臺

近年來，多種胃腸道病原體檢測平臺相繼問世，能同時檢測十余種致病性腸道病毒、細菌和寄生蟲，較傳統方法更加靈敏、快捷，可用于臨床快速診斷。FDA批準的xTAG Gastrointestinal Pathogen Panel (GPP) (Luminex, Austin, TX)平臺可以同步檢測包括NoV在內的3種病毒、3種寄生蟲及7種細菌，并能區分NoV GⅠ/GⅡ基因組，其靈敏度>90%，特異度近100%[53]。與此類似，FilmArray GI panel能夠同時檢測包括NoV在內的23種病原，但不能區分NoV GⅠ和GⅡ基因組，除了個別的病原體，其總體靈敏度同樣>90%，特異度達100%。與xTAG GPP相比，FilmArray GI樣品處理更簡單，出結果的時間更短，缺點是一次只能分析1個樣本，8 h只能處理7～8個樣本。相比之下，xTAG GPP通量更高，8 h能夠處理多達64個樣本，所以更適合大批量檢測。但是xTAG GPP是一個開放平臺，增加了復制子污染風險，故應使用單向工作流并注意實驗室操作規范[54]。此外，Life Technologies開發的TaqMan Array Card (TAC)是點陣芯片卡RT-qPCR平臺，通過空間分布來實現多病原的檢測。它是由384個孔組成的微流體芯片卡，被分成8個區域，每個區域包括48個孔，預裝有特異性引物和TaqMan探針，每卡可加載8個樣本，同時檢測19種病原。與使用相同引物和探針的RT-PCR Luminex assay相比，TAC的靈敏度為100%，特異度為96.2%[55]。雖然這些檢測平臺可以快速診斷多種病原，但因經常出現混合感染和缺乏定量數據，故可能無法確定胃腸道疾病是由哪種病原造成，需要通過別的方法進一步驗證。

3.3 二代測序

二代測序(next-generation sequencing, NGS)技術因具有高通量、高靈敏度等優勢而被廣泛用于基因組學的研究。NGS可不依賴于特異性引物而得到NoV的全基因組序列，及時發現異于常見毒株的新突變株，豐富參考序列數據庫，追蹤NoV的起源和基因進化，從而預測其潛在的暴發和流行。NGS一個極大的優勢是，所有病毒(高于敏感閾值)都可在產生的序列中表示，為臨床樣本提供重要的共感染數據[56]。然而，NGS從文庫制備到測序分析需要至少24～48 h，且需要專門的人員和設備；另外，價格昂貴，每個樣本需要100～200美元。NGS對于低豐度病毒的測序非常有用，但這也提高了樣本之間發生交叉污染的風險。

4 展望

目前，對HuNoV感染致病機制的了解大部分來自人體攻毒試驗研究，以及主要利用小鼠模型進行的替代研究。這些模型受成本、試劑和倫理的限制。盡管小鼠模型成本低廉，但無法繁殖HuNoV。MuNoV和HuNoV在與宿主的相互作用及引起疾病方面有很大差異。因此，未來的致病機制研究應聚焦更能代表人小腸上皮細胞的體內與體外模型的構建，包括能感染HuNoV的動物感染與疾病模型，以及人小腸類器官模型。此外，還應關注腸道微生態與HuNoV感染、復制和致病的相關性，以全面理解NoV的致病機制，為疫苗和治療藥物的研發，乃至最終治療和預防NoV胃腸炎提供不可或缺的基礎。