結核分枝桿菌硫醇乙酰基轉移酶基因敲除株的構建及其生物學特性分析

葛文雪，陳潤，白嘉誠，狄玉昌，張雪蓮

復旦大學生命科學學院遺傳工程國家重點實驗室，上海 200433

結核病仍然是威脅人類健康的重大疾病，世界衛生組織(World Health Organization，WHO) 2018年數據顯示，2017年度全球共有 1 010 萬新發病例及160萬死亡病例[1]。結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tuberculosis)是結核病的病原菌，其感染致病機制復雜，是該領域研究的難點[2]。近年來有研究表明, 結核分枝桿菌結構域蛋白的乙酰化修飾可能與其毒力和潛伏感染相關[3-4]。Nε-Lys乙酰化是蛋白翻譯后修飾的一種方式，對細菌的生長和代謝具有重要作用[5]。從結核分枝桿菌基因組信息分析得知結核分枝桿菌中有20余種具Gcn5 N-acetyltransferase(GNAT)結構 域的蛋白，硫醇乙酰基轉移酶(mycothiol acetyltransferase, MshD)是其中一個較重要的酶。該酶參與催化硫醇合成的最后一步反應，將乙酰CoA的乙酰基轉移至硫醇前體，進而形成完整的硫醇。硫醇是結核分枝桿菌中主要的低相對分子質量醇，對維持細菌內的氧化還原穩態起重要作用[6-7]。

本實驗以無毒的H37Ra菌株作為研究對象，根據同源重組原理，利用噬菌體侵染技術[8-9]構建mshD基因敲除株，并對其生物學特性進行分析，以期為后續深入開展該基因的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 引物設計與合成根據美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中結核分枝桿菌減毒株H37Ra的基因位置及序列分別設計mshD基因及其同源臂的引物，詳見表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 試驗用PCR引物

Tab.1 PCR primer sequences used in this study

PrimeSequence(5′→3′)Ampliconsize/bpNotemshDLSTTTTTTTTCCATAAATTGGAACTGGGAGACGCCTTTCCC850Van91ⅠmshDLATTTTTTTTCCATTTCTTGGCTGCGCTGCTCGTCGGCGGTVan91ⅠmshDRSTTTTTTTTCCATAGATTGGACCACCTACAGCGTCGATAC850Van91ⅠmshDRATTTTTTTTCCATCTTTTGGATGTAGTCCTCGGTGGCCTTVan91ⅠmshDFATAGAATTCGTGACGGCGCTTGACTGGCG948EcoRⅠmshDRTATAAGCTTTCAGTTATCCGTGCCAGCCAGCGHindⅢ

1.1.2 菌株、試劑大腸埃希菌DH5α、結核分枝桿菌減毒株H37Ra、恥垢分枝桿菌mc2155、pMV361質粒均為本實驗保存；大腸埃希菌TOP10、HB101菌株，p0004S、phAE159質粒均由美國W. R. Jacobs實驗室提供；prime STAR DNA polymerase、Van91Ⅰ 限制性內切酶、T4連接酶、PacⅠ 限制性內切酶、CIP堿性去磷酸化酶均購自美國New England Biolabs公司；plasmid DNA extract kit 、DNA gel extraction kit購自美國Axygen公司；噬菌體包裝試劑盒MaxPlax lambda packaging extract 購自美國Epicentre生物技術公司；hygromycin、ampicillin、kanamycin購自德國Sigma公司；RT-qPCR所用試劑購自日本Takara公司；MP 緩沖液﹝包含25 mL 1 mol/L Tris-HCl (pH 7.4)、5 mL 1 mol/L MgSO4、1 mL 1 mol/L CaCl2、15 mL 5 mol/L NaCl﹞購自上海生工生物工程有限公司；OADC(100 mL)包括5 g bovine albumin fraction V(上海艾研生物科技有限公司)、0.03 g catalase(德國Sigma公司)、2 g glucose、0.85 g NaCl、12 μL oleic acid(上海生工生物工程有限公司)。

1.1.3 儀器宏觀變倍體式顯微鏡(型號：Stereo Discovery. V20)購自德國卡爾蔡司公司。

1.2 敲除株與回補株的構建

1.2.1mshD基因敲除株的構建[10]用mshDLS mshDLA、mshDRS mshDRA兩對引物分別擴增mshD基因上下游各800 bp的同源臂序列，限制性內切酶Van91Ⅰ 酶切同源臂及p0004S質粒，連接酶切產物并將重組質粒通過熱激法轉入大腸埃希菌TOP10感受態，挑取單菌落過夜培養并抽取質粒，將質粒送至上海生工生物工程有限公司測序驗證。將成功構建的mshD-p0004S質粒連接至分枝桿菌類穿梭質粒phAE159，使用限制性內切酶PacⅠ及噬菌體包裝試劑盒完成穿梭質粒mshD-phAE159的構建。將穿梭質粒mshD-phAE159通過電轉化方法轉入恥垢分枝桿菌感受態，待長出噬菌斑后，收集噬菌斑，置于MP 緩沖液中，4 ℃放置過夜。吸取100 μL噬菌體、300 μL新鮮培養的恥垢分枝桿菌與溫熱的4 mL Top Agar，混勻，平鋪在LB固體培養基上，于30 ℃培養箱中靜置培養3 d后，將上層培養基收集到適量MP 緩沖液中，4 ℃放置過夜。重復上述擴增步驟，直至噬菌體滴度達到1010PFU/mL及敲除菌株與噬菌體濃度比例達到1∶10以上。高滴度噬菌體與H37Ra感受態于37 ℃孵育3～4 h后，再加入10 mL 7H9 OADC培養基復蘇16～24 h，離心收集菌體并涂布于7H10 OADC固體培養基(75 μg/mL hyg)，37 ℃培養4～6周。挑取單菌落，置于5 mL 7H9 OADC液體培養基中，37 ℃培養20 d，抽取菌體基因組并以基因組為模板PCR擴增目的基因。引物：mshDLS、mshDRA(表1)；程序： 98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，64 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，29個循環。PCR產物送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.2mshD基因回補株的構建使用引物mshDF、mshDR(表1)對H37Ra基因組進行PCR擴增獲得mshD基因，用限制性內切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ同時酶切mshD基因片段及pMV361質粒。連接酶切產物，并將重組質粒通過熱激法轉入大腸埃希菌DH5α感受態，涂布于LB固體培養基(50 μg/mL Kana)，37 ℃倒置培養過夜。挑取單菌落，置于5 mL LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min過夜培養并抽取質粒，質粒送至上海生工生物工程有限公司測序驗證。將構建成功的mshD-pMV361質粒電轉入H37RamshD基因敲除株感受態，待長出單菌落后，挑取并置5 mL 7H9 OADC液體培養基中，37 ℃培養20 d。最后收集菌體，抽取其基因組，并以基因組為模板PCR擴增目的基因。引物：mshDF、mshDR(表1)；程序：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，64 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，29個循環。PCR產物送上海生工生物工程有限公司測序，同時以野生株基因組為模板做對照。

1.2.3 轉錄水平驗證分別收集對數期野生株、敲除株、回補株菌液各10 mL，并對其進行RNA抽提及RT-qPCR驗證。RT-qPCR反應條件：10 μL 2×T5 Fast qPCR Mix，0.8 μL 10 μmol/L Primer-F，0.8 μL 10 μmol/L Primer-R，1 μL cDNA，0.2 μL 50×ROX Reference DyeⅠ，ddH2O補齊至20 μL。程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s，40個循環。

1.3 敲除株生物學特性鑒定

1.3.1 菌落形態觀察分別收集WT、KO、COM對數期菌液各5 mL，低頻水浴超聲，參數：超聲15 s，停止15 s，8個循環；靜置20 min，轉移上清液至新的無菌離心管，制備菌懸液。用7H9 OADC培養基調整菌懸液濃度至OD600為0.3，并將菌液進行10倍梯度稀釋至菌濃度為10-4。取100 μL稀釋后的菌液涂布于7H10 OADC培養基，封口膜封口，37 ℃ 倒置培養4～6周。使用宏觀變倍體式顯微鏡觀察菌落形態。

1.3.2 生物膜形成觀察制備菌懸液，4 000 r/min離心收集菌體，用Sauton培養基調整菌濃度至OD600為0.3，稀釋30倍，于24孔板中分別加入1.3 mL稀釋后的菌液，實驗設置3個復孔。最后用封口膜封口，錫箔紙包裹， 37 ℃培養箱中靜置培養4～6周。宏觀變倍體式顯微鏡下觀察生物膜的形成。

1.3.3 生長曲線測定制備菌懸液，4 000 r/min離心收集菌體，用PBS分別調整WT、KO、COM菌濃度至OD600為0.6，按1∶50比例轉接入7H9 OADC培養基，37 ℃培養箱中靜置培養。每隔1 d定點取樣，測定OD600的值，實驗設置3個復孔。

1.3.4 敲除株與野生株抗脅迫能力檢測制備菌懸液，4 000 r/min離心收集菌體，用PBS調整菌濃度至OD600為0.2，用5 mmol/L H2O2、0.05% SDS在50 ℃熱激處理菌液1.5 h以及低氧處理5、10、15 d。低氧處理方式：用15 mL離心管，2/3裝液量，石蠟封口，于37 ℃靜置培養。將菌液進行10倍梯度稀釋至菌濃度為10-3和10-2，取100 μL菌液涂布于7H10 OADC培養基，37 ℃培養箱中倒置培養 4～6周。最后進行菌落計數，計算存活率。

1.4 統計學方法

上述實驗均設置生物學及技術重復各3次。其中，菌體存活率為脅迫處理后的菌體CFU與未經處理的菌體CFU的比值。

2 結果

2.1 構建出mshD基因敲除株

以敲除株基因組為模板，用mshD基因左臂上游引物和mshD基因右臂下游引物進行PCR擴增，得到mshD基因長度為948 bp，左臂右臂序列長度均為800 bp，表明mshD基因已被敲除，此時mshD基因被sacB和hyg基因替換(圖1A)。以H37Ra基因組為模板，用左臂上游引物和右臂下游引物進行PCR擴增得到 2 548 bp的序列片段，為同源臂序列長度與mshD基因序列長度的總和。以敲除株基因組為模板進行PCR擴增得到 5 200 bp的序列片段(圖1B)，為同源臂序列長度與sacB和hyg基因序列長度的總和。將PCR產物純化后送至上海生工生物工程有限公司測序，結果顯示目的基因大小與預測結果一致。

A: Homologous recombination schematic.mshDgene replaced bysacBandhyggenes. B: PCR electrophoresis identification. M: 12 000 bp marker; 1: genome of knockout strain, the annealing temperature is 62 ℃; 2: genome of knockout strain, the annealing temperature is 64 ℃; 3: genome of H37Ra, the annealing temperature is 62 ℃; 4: genome of H37Ra, the annealing temperature is 64 ℃.

圖1mshD基因敲除株基因組PCR驗證電泳圖

Fig.1 PCR identification of themshDgene knockout strain

2.2 構建出mshD基因回補株

以回補株基因組為模板，用mshD基因上下游引物進行PCR擴增，同時以野生株基因組為模板做對照。結果得到948 bp的基因片段，與對照結果一致(圖2)。說明目的基因定點整合到H37Ra基因組上，mshD基因回補株構建成功。

M: 10000 bp DNA marker; 1: genome of H37Ra; 2: genome of the knockout strain; 3: genome of the complemented strain.

圖2 H37Ra野生株、mshD基因敲除株及回補株PCR驗證電泳圖

Fig.2 PCR identification of H37Ra,mshDgene knockout strain and complemented strain

2.3 敲除株mshD基因的轉錄水平為零

RT-QPCR驗證結果顯示(圖3)，敲除株中mshD基因的轉錄水平為零，至此說明mshD基因敲除成功；由于本實驗的pMV361質粒上攜帶Hsp60強啟動子，結果致使回補株中mshD基因的轉錄水平近似為野生株的4倍。

圖3 H37Ra野生株、mshD基因敲除株及回補株轉錄水平驗證

Fig.3 Verification of H37Ra,mshDgene knockout strain and complemented strain at the transcription level

2.4 敲除株菌落偏小

與野生株相比，敲除株菌落褶皺減少，且菌落偏小；回補株菌落扁平，呈白色，無明顯褶皺。野生株和回補株在培養4周時已形成菌落，而敲除株直至6周時才形成大小適宜的菌落(圖4)。

2.5 敲除株生物膜形成較慢

將生物膜置于宏觀變倍體式顯微鏡下觀察(圖5)，結果顯示4周時，敲除株生物膜并沒有完全形成，而野生株和回補株生物膜已形成，且褶皺明顯；6周時，敲除株生物膜已形成，但膜的厚度<野生株和回補株，且褶皺較少。

圖4 H37Ra野生株、mshD基因敲除株及回補株菌落形態

Fig.4 Colony morphology of H37Ra,mshDgene knockout strain and complemented strain

圖5 H37Ra野生株、mshD基因敲除株及回補株生物膜

Fig.5 Biofilm formation of H37Ra,mshDgene knockout strain and complemented strain

2.6 敲除株生長速率減緩

從生長曲線的結果可以看出，mshD基因敲除株的生長曲線始終低于野生株和回補株，而回補株的生長曲線和野生株基本保持一致(圖6)。綜合上述結果，認為此回補株具有一定的參考意義。同時也進一步說明了mshD基因對菌體生長具有重要作用，該基因的缺失明顯抑制了菌體生長。

2.7 敲除株抗脅迫能力下降

抗脅迫實驗的結果顯示(圖7)，在5 mmol/L H2O2和0.05%SDS作用下敲除株存活率略低于野生株和回補株，這種差異在低氧處理及50 ℃熱激作用下更加顯著。在低氧處理5 d時，野生株、敲除株、回補株生長均不受影響；低氧處理10 d時，野生株和回補株生長仍不受影響，但敲除株的存活率驟然下降至約3%；低氧處理15 d時，野生株和回補株的存活率下降至約50%，而敲除株的存活率下降至約2%。

圖6 H37Ra野生株、mshD基因敲除株及回補株生長曲線

Fig.6 Growth curves of H37Ra,mshDgene knockout strain and complemented strain

A: Analysis of antioxidant capacity of different strains. B: Analysis of anti-hypoxia ability of different strains. C: Analysis of anti-detergent ability of different strains. D: Analysis of heat resistance of different strains.**:P<0.01;***:P<0.001.

圖7 H37Ra野生株、mshD基因敲除株及回補株耐H2O2、低氧、SDS和熱激的能力

Fig.7 The ability of H37Ra,mshDgene knockout strain and complemented strain resistant to H2O2, hypoxia, SDS and heat shock

3 討論

硫醇是存在于分枝桿菌和其他多數放線菌中的小分子醇類，具有維持細胞氧化還原穩態和抗毒素作用[11]。在結核分枝桿菌中，硫醇的合成依次需要硫醇糖基轉移酶MshA、硫醇去乙酰化酶MshB、硫醇連接酶MshC、MshD的參與[12]。MshD參與催化硫醇合成的最后一步反應，能將acetyl-coenzyme A (CoA) 的乙酰基團轉移至硫醇前體Cys-GlcN-Ins，進而形成完整的硫醇。Vetting等[13]解析了MshD蛋白的晶體結構，發現該蛋白由2個結構域組成，呈β1α1α2β2β3β4α3β5α4β6拓撲結構。Rawat等[14-15]探索了恥垢分枝桿菌中硫醇的合成途徑及MshD缺失對菌體的影響。Buchmeier等[12]對結核分枝桿菌Erdman株的研究發現，當MshD缺失后，硫醇含量只有野生株含量的1%，硫醇前體的含量處于較高水平。此外有研究表明，MshD可能與結核病的快速診斷相關。目前大多數臨床診斷測試的靈敏度不高，特異性不強，且檢測周期較長[16]。近年來分子生物學診斷方法的出現為結核病的治療拓寬了思路，最新研究發現可通過對菌體抗原的檢測實現結核病的精準診斷[17]。Zeitoun等[18]研究發現在大量結核病患者的血清中均檢測出MshD蛋白，因此認為MshD可作為一種潛在的新型生物標志物用于活動性結核病的診斷。

結核分枝桿菌侵染宿主后，需應對機體內一系列的逆環境，其中包括巨噬細胞內的低氧環境。結核分枝桿菌在胞外環境生存時也同樣會遇到壓力刺激，因此菌體的抗脅迫能力與其胞內外的生存能力密切相關。本研究結果顯示，mshD基因敲除株菌落形態及大小都發生了變化，生物膜形成能力也相對減弱，生長明顯變慢，抗脅迫能力下降。這說明在結核分枝桿菌中mshD基因對菌體生長代謝具有重要的作用，可能原因是MshD的缺失導致硫醇合成受影響，進而導致菌體生長及代謝的變化。由于本實驗前期嘗試多次并未構建成功攜帶自身啟動子的pMV361質粒，故而選擇使用帶有Hsp60啟動子的pMV361質粒。雖然回補株mshD基因的轉錄水平比野生株高近4倍，但仍然可為后期實驗提供一定的參考價值。本研究結果為MshD作為新型生物標志物用于診斷活動性結核病提供了實驗依據。

結核分枝桿菌的乙酰化修飾對菌體的生長和代謝具有重要作用，近年來研究表明乙酰化可能與結核分枝桿菌的毒力和潛伏感染相關。基因組分析表明，結核分枝桿菌硫醇乙酰化酶MshD屬于GNAT家族，而與GNAT家族其他蛋白不同，MshD包括兩個乙酰轉移酶的結構域，且這兩個結構域的C端序列高度同源。MshD作為乙酰化酶參與了結核分枝桿菌硫醇的合成，但其是否會影響菌體蛋白的乙酰化修飾及其他代謝通路活性還有待深入研究。在結核分枝桿菌中，硫醇的缺失導致菌體生長明顯被抑制，且硫醇對維持細菌內的氧化還原穩態起重要作用，作為可在細胞內生存的結核分枝桿菌，硫醇對其應對巨噬細胞內不利微環境是否起重要調控作用，尚需進一步探索。