肽核酸單體的合成進展及其在腫瘤醫學研究中的應用*

陳朗軍，吳林燁，李達諒

（福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117）

DNA是重要的遺傳物質，在遺傳信息的傳遞、復制中發揮著重要作用。很多疾病是由于某些關鍵基因DNA發生突變或損傷引起的，如鐮刀型細胞貧血病等[1,2]。對于這些疾病的診斷和治療則需要借助特定的工具。寡核苷酸具有鏈長短，序列復雜度低等特點，適用于開發新型治療用藥物[3]、或是設計新型分子生物學研究工具[4]，但寡核苷酸存在著一些不足與缺陷，如其抵御核酸酶降解的能力較弱、雜交分子的熱穩定性差、會同蛋白產生非特異性結合等。為了有效克服寡核苷酸的這些缺點，眾多的核酸類似物在參考核酸基本結構的基礎上被設計合成出來。肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）因其獨特新穎的物理化學及生物化學特性、穩定性和對核酸酶與蛋白酶的良好抗性，與互補鏈顯著的相互作用和顯著的雜交屬性而成為其中一個單獨的且值得注意的類別[5]。基于其獨特的性質，PNA在分子雜交和診斷領域發揮重要作用，有望被開發成為抗腫瘤的新型免疫制劑。本文對PNA的合成以及其在腫瘤免疫學研究中的應用進行綜述。

1 肽核酸的結構和特性

1.1 肽核酸的化學結構及其理化性質

PNA的化學結構同DNA和RNA類似，均是由骨架、堿基以及堿基同骨架連接部分組成，不同之處在于構成PNA的單體之間是通過一個非自然的假肽鏈相互連接，其結構如圖1所示。

圖1 DNA和PNA骨架結構對比

由于肽核酸是通過非自然的假肽鏈進行連接的，故其具有一些核酸不具備的獨特性質：

⑴ 相比帶有負電荷的DNA和RNA的核糖磷酸骨架，肽核酸的骨架是不帶電荷的，這就減少了其雙鏈間的排斥作用，從而具有比DNA或RNA更高的親和力和穩定性。

⑵ 由于肽核酸為外界人工合成的類核酸物質，結構中不含氨基酸殘基或磷酸戊糖單元，故絕大部分的核酸酶和蛋白酶無法對其進行有效降解。

⑶ 肽核酸的非手性構象便于單體合成與純化，骨架含有重復的酰胺鍵結構，故可以使用固相合成方法合成寡聚物。

⑷ 通過將生物素、熒光素與合成的肽核酸序列進行連接形成帶標記的特異性探針。

1.2 肽核酸同DNA和RNA的雜交特性

⑴ 由于PNA在雜交時具有的高度特異性，使得PNA-核酸雜交分子一旦出現錯配，將大大降低其穩定性[6]。

⑵ 與DNA和RNA不同，肽核酸骨架是不帶電荷的。這使得其具有比核酸雜交分子更高的熱穩定性。Jensen等[7]發現PNA雜交分子所需的解鏈溫度（Tm值）要比相應的核酸雜交分子高出許多。

⑶ PNA在與互補DNA或RNA序列雜交時，有兩種結合方式：一種是采取與DNA分子相同的反向平行互補的方式進行雜交；一種則是通過正向平行互補的方式[8]。

⑷ DNA/DNA雜交分子的一大缺陷即是受鹽離子濃度影響很大，只有在一定鹽離子濃度條件下，DNA分子才能穩定存在。PNA雜交分子則不存在此問題，在鹽離子濃度很低的條件下，PNA也仍可以與核酸分子穩定雜交[9]。

2 肽核酸的合成

由于肽核酸具有骨架呈電中性、生物穩定性較高、容易和DNA或RNA結合形成穩定的復合物等方面優點，近年來針對肽核酸修飾與合成的研究具有很高的熱度。肽核酸本身的化學結構較為簡單，故其合成方法并不繁瑣。從結構上可知肽核酸是由許多肽核酸單體聚合而成的，所以合成它的重點在于單體的合成。

2.1 PNA骨架的合成

PNA單體主要由三部分組成，一是骨架部分，二是堿基部分，三是堿基和骨架的連接部分。其合成始于對N-(2-氨基乙基)甘氨酸骨架的合成，然后是對堿基的保護，最后將堿基與骨架進行連接。合成骨架的常用方法有3種[10]。

⑴ 以乙二胺或乙腈為原料，與鹵代乙酸衍生物發生烷基化反應[11,12]，見圖2a。

⑵ 還原保護的氨基乙醛和甘氨酸酯形成的席夫堿[13]，見圖2b。

⑶ 利用帶有叔丁氧碳基（t-Butyloxy carbonyl，Boc）保護的氨基乙醇與帶有對硝基苯基甲磺酰基（o-NBS）保護的甘氨酸酯進行Mitsunobu反應合成PNA骨架[14]，見圖2c。

圖2 PNA單體骨架的合成

2.2 PNA單體的形成

結束骨架部分的合成，即可進行堿基的保護。由于5種核酸堿基中有些帶有活潑氨基，故應先將其保護起來，才能使得烷基化反應發生在特定的沒有保護的氮上，形成相應的堿基乙酸衍生物。常用的保護基團有芐甲氧碳基[11]（benzyloxycarbonyl，Cbz）、叔丁氧碳基（t-Butyloxy carbonyl，Boc）[15]等。

胸腺嘧啶和尿嘧啶不含有活潑氨基，故可以直接與鹵代乙酸酯發生反應。胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤均含有活潑氨基，故需先對氨基基團加以保護后，才能使反應在期望的正確位置進行。三者中腺嘌呤和胞嘧啶的保護方法相似，均采用的是先對活潑氨基進行保護；再同鹵代乙酸酯反應，生成相應的堿基乙酸酯；最后利用溶解于二氯甲烷中的三氟乙酸去除甲酯，得到所需的乙酸衍生物。鳥嘌呤的保護相對繁瑣，需要排除N7烷基化副反應的干擾[10]。故常用的方法是以2-氨基-6-氯嘌呤為底物，烷基化反應后再將氯水解為碳基[16]（圖3）。

圖3 核酸堿基乙酸衍生物的合成

圖4 堿基乙酸與PNA骨架相連

最后，參考多肽合成的方法，選取合適縮合劑將所得堿基乙酸衍生物同骨架上未保護的氮原子相連接，即可得相應的PNA單體[17]，見圖4。

3 肽核酸的應用

正是由于肽核酸單體合成條件較為簡單，步驟也較少，合成原料也價廉易得，故容易大量制備，并廣泛應用于醫藥衛生領域。如：根據其不帶電荷的特性設計合成的PNA探針，可以對食物中的病原微生物進行快速篩選檢測[18]；也可以通過設計合成能夠靶向病原菌相關致病基因的反義肽核酸序列，并與細胞穿膜肽進行連接，形成多肽-肽核酸重組序列（peptide-PNA, PPNA），其能夠抑制病原菌的生長和相關致病基因的復制[19,20]。此外，肽核酸在腫瘤治療和診斷領域也具有很高的研究價值。如：肽核酸能夠調控與腫瘤發生相關基因、蛋白的表達從而達到抑制腫瘤增殖的效果；還可將其與放射性標記物或熒光基團結合從而實現對腫瘤的實時檢測和診斷。以下4例為其在腫瘤免疫研究中的具體應用。

3.1 PNA可以抑制端粒酶活性

人類腫瘤里幾乎均可檢測到端粒酶活性，且其可能對腫瘤的增殖起著關鍵的作用。可以通過表達人源端粒的反義RNA互補產物來抑制端粒酶活性，從而起到抑制腫瘤細胞系端粒長度延伸的作用。

已有研究定性地檢測到DNA寡核苷酸會與人源端粒RNA或纖毛蟲端粒酶RNA互補從而抑制端粒酶活性。然而，DNA寡核苷酸容易被核酸酶降解而不太適用于在細胞粗提物和生物體中使用。因此需要一種高效且化學穩定的抑制劑。有研究表明，PNA同RNA或DNA會形成非常穩定的三螺旋結構[21]，故在選取抑制DNA或RNA酶活性的分子通道阻劑時常考慮使用PNA分子。Norton等[22]發現PNA寡聚體可以抑制端粒酶活性，其半抑制濃度(IC50)最低可低至900 pM。且因PNA具有選擇性好、效率高等優點，故被認為是能夠檢測胞內端粒酶功能的有用化合物。

3.2 肽核酸-抗體結合物在腫瘤放射性檢測和治療的應用

傳統的攜帶有放射性核素的腫瘤特異性單克隆抗體（mAbs），由于其具有較高的分子量而存在分子大小相關的生物透過障礙[23]，如：“外滲作用、腎小球過濾障礙”。故mAbs會在腫瘤位點逐漸積累，以致在血液中滯留數天[24]。在血液中緩慢的清除速率將會使得給藥后的圖像采集時間延長，而在非靶點組織的積累將會引起非腫瘤細胞的放射性損傷。肽核酸由于其在生物體內的高度代謝穩定性和較少的非特異累積而成為理想的癌癥診斷和治療候選物。Leonidova等[25]將未標記的，具有高度特異性的抗體-PNA結合物先行導入生物體內并靶向腫瘤細胞，隨后再將帶有放射性標記的互補PNA導入使其與抗體-PNA在腫瘤位點進行雜交，從而達到腫瘤定位效果。這一方法的優勢在于使抗體-PNA結合物有充足的時間與腫瘤結合，并可以從非特異性結合位點上清除；而采用小型快速清除的放射標記則有效避免了其在血液中累積而產生細胞毒性。故該法在癌癥的放射性檢測及治療領域有著巨大的潛力。

3.3 利用細胞滲透性的γ胍基肽核酸降低肝腫瘤細胞中的β-連環蛋白表達

在肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中，許多異常激活的信號通路被鑒定出來，并成為富有吸引力的治療靶點，Wnt/β-連環蛋白通路就是其中之一[26]。突變及失控的β-連環蛋白在肝癌發生中扮演重要角色[27]，在約30%的HCCs中，由于CTNNB1基因的exon-3上絲氨酸或蘇氨酸編碼堿基發生的點突變將會使得β-連環蛋白具有穩定而持續的活性。β-連環蛋白異常激活與腫瘤細胞的增殖和存活息息相關，使得其成為肝細胞癌患者亞群中的一個有效治療靶點[28]。Delgado等[29]通過設計一種新型的細胞滲透型的γ胍基肽核酸（γGPNA）反義寡核苷酸，其能與β-連環蛋白基因的轉錄或翻譯起始位點進行配對，從而降低β-連環蛋白在肝腫瘤細胞內的表達，影響肝腫瘤細胞的增殖和活力。此外，β-連環蛋白在肝癌細胞的下調也影響了一些血管生成因子的表達，這些因子會引起HCC相關內表皮細胞的小管形成和管腺增生減少，因此γGPNA在HCC治療方面有著重要的意義。

3.4 利用合適的PNA分子信標檢測活細胞及結腸組織腺癌內的長鏈非編碼RNA(CCAT1)

大腸癌（colorectal cancer，CRC）的演進很大程度上取決于基因改變的積累。過去幾年，非編碼RNA在基因表達和調控以及在腫瘤發生中的功能引起了科研工作者的關注。有研究表明長鏈非編碼RNA（lncRNA）在細胞增殖和入侵方面具有潛力，一些lncRNA在癌癥組織和癌癥細胞系中過表達，而另一些則和較差的癌癥預后以及轉移相關。Nissan等[30]鑒定了大腸癌相關轉錄子-1（CCAT-1）在CRC和正常組織中高度表達，由于CCAT1在大多數初始CRC腫瘤中是上調表達的，所以它可以作為一種實時體內成像的有效靶標。

為了檢測廣泛的結腸癌，Kam等[31]進一步設計PNA分子信標（PNA-MBs）從而使其不僅靶向體細胞突變，而且靶向結腸癌以及腺瘤內上調的細胞內轉錄本，如：CCAT1，lncRNA。所有染色腺瘤和腺癌與K8-180-TOPNA-MB孵育后，均有較強的熒光，而同一病人的正常組織與其進行孵育后則熒光強度減弱很多。這與之前證實CCAT1在腺瘤和癌中高表達而在正常結腸粘膜組織上低表達的PCR數據一致，這表明PNA-MBs在臨床上可以被用于實時鑒別腺瘤和良性息肉，如增生性息肉或錯構瘤，而其高度的敏感性則將可以快速和簡單地對病變部位進行活檢。

4 展望

自肽核酸于1991年由Nielsen等在實驗室成功合成以來，由于其獨特的雜交特性與優良的生物穩定性而倍受研究者的青睞。經過近三十年的發展，PNA的合成及其應用正在逐步走向成熟。在合成方面，對其經典結構的合成已經較為成熟，而針對其經典結構改造與修飾的研究也層出不窮，改造主要集中于對PNA骨架的修飾[32-34]、改變堿基與骨架的聯接位置與方式[35-37]、對堿基的替代三方面。通過對PNA進行修飾和改造，使其細胞攝取率與細胞內靶向性得到提升。

由于PNA具有很高的序列雜交特異性以及對于錯配堿基的分辨能力，故利用其開發新型診斷探針和調控基因表達仍將是其未來的主要研究方向之一。此外，還可以利用PNA結構簡單易合成的特性，嘗試合成一些以其為底物的小分子藥物，如：cGAMP、cGMP、cAMP的肽核酸類似物，再將其用于細胞免疫測試，觀察其對于cGAS-STING[38]等信號通路的調節作用，若具有一定增強或抑制活性，則有望開發出新型的免疫制劑。