褪黑素聯合順鉑促進大鼠胰腺癌AR42J細胞凋亡

龐林榮 陳俊 陸靜爾 黃佳 徐彩虹 程曉春 李暉 周欣

浙江省寧波市鄞州人民醫院腫瘤放化療中心，寧波 315040

褪黑素具有多種生理功能[1]，它對腫瘤細胞有抗氧化性、抑瘤性和促凋亡活性，是抗癌劑或聯合治療的理想候選藥物之一[2]。大多數化療藥物是線粒體介導的內源性凋亡途徑的典型激活劑，且細胞內活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的大量蓄積可導致線粒體損傷進而誘導腫瘤細胞凋亡[3-4]。內源性凋亡途徑始于caspase-9的激活，然后激活caspase-3、6和7，通過下游半胱天冬酶切割特定細胞底物蛋白質，促使細胞凋亡[5-6]。對癌癥患者的初步臨床研究表明，褪黑素可以降低腫瘤的復發率，延長患者生存時間[7]。然而，關于褪黑素與化療藥物聯合應用對胰腺癌細胞凋亡的影響及機制目前尚不清楚。本研究觀察褪黑素聯合順鉑對大鼠胰腺癌細胞株AR42J細胞凋亡的影響，探討其可能的作用機制。

材料和方法

一、細胞培養及分組

大鼠胰腺癌細胞株AR42J購于上海酶研生物科技有限公司，常規復蘇、傳代。實驗分兩部分，第一部分實驗分為對照組、1 mmol/L順鉑處理組(順鉑組)、1 mmol/L褪黑素處理組(褪黑素組)、1 mmol/L順鉑加1 mmol/L褪黑素聯合處理組(聯合組)；第二部分實驗分為對照組、聯合組、1 μmol/L PBN(phenyl-N-tert-butyl nitrone，ROS抑制劑)預處理1h后順鉑加褪黑素聯合處理組(PBN+聯合組)、PBN溶劑預處理1h后順鉑加褪黑素聯合處理組(溶劑+聯合組)。藥物處理濃度根據預實驗篩選獲得。

二、細胞增殖檢測

使用MTT法檢測細胞增殖活性，試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司。取各組對數生長期細胞，以每孔2×106個細胞密度接種于24孔板，根據分組分別給予相應的藥物處理。培養24 h后棄培養液，加入含MTT的培養液繼續培養4 h，上酶標儀檢測各孔490 nm波長的吸光度值(A490值)。每組設3個復孔，取均值。細胞增殖率=實驗組A490值/對照組A490值×100%。

三、細胞凋亡檢測

采用Annexin V-FITC/PI 法檢測細胞凋亡，檢測試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司。各組細胞藥物處理24 h后，用含0.2%胰蛋白酶的EDTA分離細胞，PBS洗滌兩次，1 000 r/min離心5 min后棄上清液，用含有V-FITC的95 μl緩沖液重懸細胞，然后加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)，上流式細胞儀(Cytomycs FC-500，美國Beckman-Coulter公司)測細胞凋亡。每個樣本測試3次，取均值。

四、ROS水平檢測

使用2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)法檢測各組細胞內ROS水平，DCFH-DA購于美國Molecular Probes公司。取各組培養24 h的細胞，用PBS洗滌2次，加入無血清培養基中稀釋的DCFH-DA，終濃度為20 μmol/L。在暗箱中37 ℃孵育30 min后用PBS洗滌細胞2次，上激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss AG，德國)測量熒光強度，激發光波長488 nm，發射光波長525 nm。

五、細胞caspase-3蛋白表達量檢測

取各組培養24 h的細胞，用RIPA裂解液裂解細胞。蛋白定量后常規行蛋白質印跡法檢測caspase-3蛋白表達量，以β-actin為內參。抗caspase-3 一抗購于英國Abcam公司，工作濃度1∶500，抗β-actin一抗購于美國Santa Cruz公司，工作濃度1∶2 000， HRP耦聯羊抗小鼠或山羊抗兔抗體購于英國Abcam公司，工作濃度1∶5 000。最后在暗室中采用ECL發光液(上海愛必信生物科技有限公司)發光，膠片曝光、顯影、定影，掃描儀掃描膠片圖像，用Image J軟件分析各條帶的灰度值，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白表達量，以對照組為1，計算其他組表達量的百分比。

六、統計學處理

結 果

一、褪黑素聯合順鉑對細胞增殖和凋亡的影響

對照組、順鉑組、褪黑素組、聯合組細胞培養24 h后的細胞增殖率分別為(96.29±3.49)%、(81.38±6.01)%、(80.72±3.68)%、(42.26±6.35)%；細胞凋亡率分別為(16.42±4.15)%、(56.47±9.06)%、(52.94±6.57)%、(87.36±6.48)%。順鉑組、褪黑素組的細胞增殖率較對照組均顯著降低，細胞凋亡率均顯著升高；聯合組的細胞增殖率又較順鉑組、褪黑素組顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，提示褪黑素聯合順鉑處理對大鼠胰腺癌AR42J細胞增殖抑制及凋亡的作用強于單獨用藥處理。

二、褪黑素聯合順鉑對細胞ROS水平的影響

對照組、順鉑組、褪黑素組、聯合組細胞培養24 h后ROS陽性細胞占比分別為(1.33±1.53)%、(46.67±7.64)%、(45.67±5.13)%、(83.33±7.64)%。順鉑組、褪黑素組ROS陽性細胞占比較對照組顯著增加；聯合組ROS陽性細胞占比又較順鉑組、褪黑素組顯著增加，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，提示褪黑素聯合順鉑處理促進大鼠胰腺癌AR42J細胞產生ROS，其作用強于單獨用藥。

三、褪黑素聯合順鉑對細胞caspase-3表達的影響

對照組、順鉑組、褪黑素組、聯合組細胞caspase-3表達量分別為100%、(150.64±7.70)%、(147.00±7.27)%、(190.04±5.07)%。順鉑組、褪黑素組細胞caspase-3表達量較對照組顯著上調，聯合組又較順鉑組、褪黑素組進一步顯著上調，差異均有統計學意義(P值均<0.05，圖1)，提示褪黑素聯合順鉑處理促進大鼠胰腺癌AR42J細胞caspase-3表達。

圖1 對照組(1)、順鉑組(2)、褪黑素組(3)、聯合組(4)細胞培養24 h后caspase-3表達

四、PBN預處理對褪黑素聯合順鉑處理細胞ROS水平的影響

對照組、聯合組、PBN+聯合組、溶劑+聯合組細胞培養24 h后ROS陽性細胞占比分別為(1.80±0.72)%、(84.90±6.13)%、(45.24±4.64)%、(86.23±6.17)%。聯合組ROS陽性細胞占比較對照組顯著增加，PBN+聯合組ROS陽性細胞占比較聯合組顯著降低，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，提示褪黑素聯合順鉑處理前給予ROS抑制劑PBN預處理可顯著逆轉褪黑素聯合順鉑處理所致大鼠胰腺癌AR42J細胞內ROS水平。

五、PBN預處理對褪黑素聯合順鉑處理細胞caspase-3表達的影響

對照組、聯合組、PBN+聯合組、溶劑+聯合組細胞培養24 h后caspase-3表達量分別為100%、(184.69±7.76)%、(124.92±9.72)%、(182.02±6.79)%。聯合組caspase-3表達量較對照組顯著上調，PBN+聯合組caspase-3表達量較聯合組顯著下調，差異均有統計學意義(P值均<0.05，圖2)，提示褪黑素聯合順鉑處理前給予PBN預處理可顯著逆轉褪黑素聯合順鉑所致大鼠胰腺癌AR42J細胞的caspase-3表達。

討 論

大鼠胰腺癌細胞AR42J是來源于重氮絲氨酸誘導大鼠胰腺生成的惡性結節，是胰腺上皮癌變[8]。文獻報道，褪黑素可促進胰腺癌、肝癌和前列腺癌細胞的凋亡[9-10]，增強多柔比星對正常非腫瘤細胞如人角質形成細胞的細胞毒性[11]。然而褪黑素對順鉑誘導的人外周血單個核細胞的細胞毒性具有保護作用[12]，也不干擾阿糖胞苷、柔紅霉素和依托泊苷導致的白血病細胞系Jurkat、MOLT-4、Daudi、HL-60、CMK和K562的細胞凋亡[13]。

圖2 對照組(1)、聯合組(2)、PBN+聯合組(3)、溶劑+聯合組(4)細胞培養24 h后caspase-3表達

細胞凋亡是一個重要的生理過程，在發育和組織內穩態中起著關鍵作用。caspase-3的激活是細胞凋亡的重要條件[14]，然而細胞凋亡也涉及廣泛的病理條件。凋亡缺陷是腫瘤發生的常見事件且是耐藥的重要因素[15]，已知各種化療藥物可觸發內源性凋亡途徑和(或)增加線粒體對凋亡信號的敏感性[16-17]。

ROS包括超氧化物、單線態氧原子、過氧化氫、羥自由基和過氧化基等，可激活腫瘤細胞內信號轉導通路，促進炎癥反應、細胞周期進程、細胞凋亡、腫瘤細胞遷移和侵襲能力等[18]。過量的活性氧會損害細胞脂質、蛋白質和DNA[19]，細胞內ROS蓄積是觸發細胞凋亡的內在途徑的機制之一，且通常伴隨著線粒體的損傷[20]。同時，ROS是內質網應激的重要調節因子，而內質網應激可觸發未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)以保護腫瘤細胞免遭死亡[21]。許多天然藥物和合成藥物通過誘導ROS的產生而發揮抗腫瘤作用[22]。細胞氧化還原內環境平衡受到活性氧耗竭系統和活性氧清除系統之間平衡的調節[23]，例如，活性氧自由基(特別是H2O2)水平的升高具有很強的致突變性，有助于提高細胞突變水平和異質性，增加ROS水平可能導致細胞增殖抑制并最終導致細胞死亡[24]。因此增加ROS蓄積從而誘導癌細胞死亡是抗癌研究的重要方向。

本研究結果顯示，褪黑素聯合順鉑處理后AR42J細胞的增殖活性較單用褪黑素或順鉑處理時顯著降低，而細胞凋亡率顯著增加，同時細胞內ROS蓄積，caspase-3表達量上調。應用ROS拮抗劑PBN預處理后，使褪黑素聯合順鉑處理的AR42J細胞內ROS水平下降，caspase-3表達下調，說明褪黑素聯合順鉑可能通過ROS/caspase-3通路促進胰腺癌AR42J細胞的凋亡，為胰腺癌治療和研究提供了新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突