馬錢子堿通過調控線粒體凋亡途徑誘導人胰腺癌CFPAC-1細胞凋亡

田龍夫 張琦 崔立華 楊磊 周易 田余 馬波

1黃岡市中心醫院腫瘤科，黃岡 438000；2天津市中西結合醫院南開醫院天津市急腹癥器官損傷中西醫結合修復重點實驗室，天津 300100；3天津市南開醫院腫瘤外Ⅱ科，天津 300100

馬錢子堿是來源于傳統中草藥馬錢子中的一種弱堿性吲哚型生物堿，又叫番木鱉堿，分子式C23H26N2O4，相對分子質量394 000，主要存在于馬前科植物馬錢子干燥的成熟種子，在《本草綱目》中記載“狀似馬之連錢，故名馬錢”。目前國內外研究發現馬錢子堿具有明顯的抗炎、鎮痛、抗腫瘤、興奮中樞神經系統、調節免疫等功效[1]，對結腸癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、白血病、膠質母細胞瘤等均具有抗腫瘤作用[2-7]，但其在治療胰腺癌方面的相關研究國內外均未見報道。本研究觀察馬錢子堿對人胰腺癌CFPAC-1細胞凋亡的影響，探討其作用機制。

材料與方法

一、材料

人胰腺癌CFPAC-1細胞系由天津市南開醫院天津市急腹癥器官損傷中西醫結合修復重點實驗室張琦博士惠贈。馬錢子堿(Brucine)購于中國成都植標化純生物技術有限公司(批號：357573)。DMEM培養基購自Gibco公司，胎牛血清購自Hyclonge公司，二甲基亞砜購自Solarbio公司，MTT粉購自Amresco公司；細胞裂解液(RIPA)和BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司，磷脂結合蛋白V/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自Wanleibio公司，花青染料(JC-1)試劑盒購自YEASEN公司，Immobilon-P轉印膜購自Millipore公司；兔抗小鼠Bcl-2、Bax、GAPDH一抗及抗兔IgG均購自Cell Signaling Technology公司。

二、細胞增殖抑制率檢測

采用MTT比色法檢測CFPAC-1細胞的增殖抑制率。CFPAC-1細胞復蘇后常規培養、傳代。取對數生長期CFPAC-1細胞，胰酶常規消化后制成單細胞懸液，按5×103個細胞/200 μl接種于96孔培養板，培養到細胞完全貼壁后清洗2次，加入含有馬錢子堿終濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L的DMEM培養液分別孵育24、48、72 h，以不加馬錢子堿干預作為對照組。每個濃度、每個培養時間均設3個復孔。培養到時間點時每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續培養4 h，吸掉上清液，每孔加入DMSO 150 μl，常溫下低速振蕩15 min，置全自動酶標儀以570 nm波長測每孔A570值，根據(1-加藥組平均A570值/對照組平均A570值)×100%公式計算增殖抑制率。

三、細胞凋亡率檢測

采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。取對數生長期CFPAC-1細胞，以3×105個細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后應用0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預48 h，以不加馬錢子堿干預作為對照組。消化并收集細胞后，取1 ml細胞懸液分別加入5 μl Annexin V-FITC染色液，混勻后室溫避光10 min，再加10 μl的PI染色液，混勻后避光反應5 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

四、線粒體膜電位檢測

采用JC-1染色法檢測細胞線粒體膜電位。取對數生長期CFPAC-1細胞接種于12孔板，待細胞完全貼壁后應用0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預48 h，以不加馬錢子堿干預作為對照組，按照JC-1試劑盒說明書步驟進行染色，置于倒置熒光顯微鏡下觀察紅、綠色熒光強度的變化并攝片。

五、細胞Bax、Bcl-2蛋白表達檢測

取對數生長期CFPAC-1細胞接種于6孔板，待細胞貼壁后采用0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預48 h，以不加馬錢子堿干預作為對照組，置冰上用RIPA裂解液裂解細胞并提取細胞總蛋白，采用BCA法定量蛋白，取40 μg樣本行蛋白質印跡法檢測細胞Bax、Bcl-2蛋白表達，以GAPDH為內參?？笲cl-2、Bax一抗1∶1 000稀釋，二抗1∶1 000稀釋，最后使用ECL發光，X片曝光、顯影、定影。用Quantity One軟件分析獲取條帶的灰度值，以目的條帶與內參條帶灰度值比為蛋白相對表達量。

六、統計學處理

結 果

一、馬錢子堿對CFPAC-1細胞的增殖抑制率

馬錢子堿干預呈濃度及時間依賴性地抑制CFPAC-1細胞的增殖，其中，同一時間0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預對CFPAC-1細胞增殖抑制率顯著高于對照組，且不同時間兩兩組間比較的差異均有統計學意義(表1)。

組別增殖抑制率24 h48 h72 h對照組0000.05 mmol/L9.43±0.4913.53±1.0317.32±0.960.1 mmol/L14.72±1.3917.43±0.5521.38±0.760.2 mmol/L18.06±0.4021.83±0.9126.41±0.850.4 mmol/L30.23±0.55a40.61±0.15a46.98±1.27a0.8 mmol/L50.17±0.75ab61.23±0.91ab70.32±0.40ab

注：同一時間不同濃度組與對照組比較，aP<0.05；同一濃度不同時間兩兩組間比較，bP<0.05

二、馬錢子堿對CFPAC-1細胞凋亡率的影響

對照組及0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預組CFPAC-1的細胞凋亡率分別為(2.92±0.46)%、(4.64±1.31)%、(13.09±0.65)%，隨藥物濃度增加而逐漸升高，其中0.8 mmol/L干預組的細胞凋亡率顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 對照組(1A)及0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預組(1B、1C)CFPAC-1細胞凋亡率比較

三、CFPAC-1細胞線粒體膜電位的變化

JC-1聚集物提示未凋亡的活細胞呈紅色熒光形式存在，JC-1熒光單體提示凋亡和壞死細胞呈綠色熒光形式存在。對照組JC-1以聚合物形式出現紅色熒光。0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預CFPAC-1細胞48 h后，隨著藥物濃度的增加紅色熒光逐漸減少，而綠色熒光逐漸增多，提示線粒體膜電位受到重度破壞而降低(圖2)。

四、馬錢子堿對CFPAC-1細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

對照組及0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預組CFPAC-1細胞的Bcl蛋白表達量分別為(0.92±0.12)、(0.67±0.14)、(0.35±0.14)mmol/L；Bax蛋白表達量分別為(0.56±0.12)、(0.85±0.10)、(1.15±0.12)mmol/L。隨馬錢子堿濃度增加，Bcl-2表達量顯著下調，而Bax表達量顯著上調，差異均有統計學意義(P值均<0.05，圖3)。

圖2 對照組(2A)及0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預組(2B、2C)48 h后CFPAC-1細胞線粒體膜電位變化(熒光顯微鏡 ×200倍；上圖為JC-1紅色熒光聚合物，下圖為JC-1綠色熒光單體)

圖3 對照組(1)及0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預組(2、3)CFPAC-1細胞Bcl-2、Bax蛋白的表達

討 論

胰腺癌是一種被稱為“癌中之王”的消化道惡性腫瘤，其病因及發病機制目前尚未完全明確，細胞凋亡在胰腺癌腫瘤發生發展中占有十分重要的地位[8]。細胞凋亡是細胞程序性死亡，線粒體凋亡途徑、死亡受體凋亡途徑和內質網途徑均參與細胞凋亡，以線粒體凋亡途徑最為經典。該途徑具有3個明顯特點：磷脂酰絲氨酸膜外翻提示早期凋亡發生，線粒體損傷體現在線粒體膜電位降低提示中期凋亡，DNA鏈斷裂提示晚期凋亡。在內源性線粒體途徑中Bcl-2家族蛋白調控線粒體完整性，包括蛋白Bcl-2相關蛋白(Bax、Bid、Bak)等[9]，Bcl-2是抑制凋亡蛋白重要基因，Bax是促進細胞凋亡蛋白關鍵基因，均為主要影響細胞凋亡的關鍵因素[10]。

近年來馬錢子堿已被逐步證實具有抗腫瘤作用，其機制主要表現在誘導細胞凋亡、抑制血管生成、調控信號通路及抗腫瘤侵襲轉移等方面[2-7]。李苗等[4]研究證實，馬錢子堿通過下調細胞周期蛋白D1和細胞周期蛋白 E的表達，阻斷G0/G1期細胞周期，抑制人肺癌細胞株PC-9的增殖。Deng等[11]研究證實，馬錢子堿能誘導人肝癌HepG2細胞增殖和凋亡，其機制是損害線粒體膜電位，引起Ca2+升高，且降低Bcl-2蛋白表達[12]。馮靜和馬艷萍[13]研究發現，馬錢子堿可上調人骨髓瘤U266細胞的半胱氨酸蛋白酶-8、Bax蛋白表達，同時下調JAK-STAT通路中轉錄激活因子-3、轉錄激活因子-5的mRNA表達，誘導細胞凋亡，同時也能阻滯細胞周期及損傷線粒體膜蛋白，致使細胞色素C釋放誘導人多發性骨髓瘤RPMI 8226細胞凋亡[7]。余志艷和李平[14]研究發現，馬錢子堿作用人乳腺癌MDA-MB-231后可下調抑制凋亡基因Bcl-2表達，上調促凋亡基因Bax和半胱氨酸蛋白酶-3表達。馬錢子堿也能明顯抑制人早幼粒白血病HL-60細胞的增殖并誘導細胞凋亡，其機制可能與上調Bax、下調Bcl-2表達有關[15]。

本研究結果顯示，馬錢子堿呈藥物劑量及時間依賴性抑制CFPAC-1細胞增殖，增加CFPAC-1的細胞凋亡率，降低線粒體膜電位變化，使Bax表達水平上調，Bcl-2表達水平下調，提示膜電位可能對線粒體凋亡途徑有一定作用，但馬錢子堿治療胰腺癌其他相關作用機制還有待后續更深入的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突