泡盛曲霉突變菌株的篩選及其分解纖維素能力的研究

邢 力 王經(jīng)偉 鄭煒達(dá)

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院 吉林市 132101 2.吉林市昌邑區(qū)孤店子鎮(zhèn)畜牧站 吉林市 132101）

泡盛曲霉廣泛存在于土壤與腐敗有機(jī)質(zhì)中，生命力強(qiáng)。研究表明泡盛曲霉具有纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、阿魏酸酯酶、單寧酶、植酸酶等多種酶活力[1-4]，且其內(nèi)毒素和外毒素非常低，在麥麩、玉米皮、蔗渣、秸稈、菌糠等資源深加工和再利用具有很廣泛的應(yīng)用前景。目前對泡盛曲霉產(chǎn)生阿魏酸酯酶方面的研究取得很好的成果并已經(jīng)商用，但是對其產(chǎn)纖維素酶的研究較少。本試驗通過紫外誘變誘導(dǎo)泡盛曲霉突變，提高泡盛曲霉對纖維素的分解能力，為纖維素含量高的農(nóng)業(yè)廢棄物再利用提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

材料：泡盛曲霉，課題組從吉林市猴石山遺址林下腐殖土分離純化并鑒定。

試劑：標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（1mg/mL）、DNS試劑。

剛果紅培養(yǎng)基：K2HPO40.5g，微晶纖維素1.88g，MgSO40.25g，明膠 2.0g，剛果紅 0.2g，瓊脂 14.0g，蒸餾水 1000mL。

馬鈴薯葡萄糖糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200g，葡糖糖20g，瓊脂 20g，水 1000mL。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，取其浸出液，加入2g羧甲基纖維素定容至1000mL，滅菌。

1.2 試驗方法

1.2.1 泡盛曲霉菌種活化

將泡盛曲霉菌種塑料凍存管立即放入40℃水浴中1min快速復(fù)蘇，將泡盛曲霉接入PDA斜面培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中24℃培養(yǎng)3d。將培養(yǎng)3d的泡盛曲霉轉(zhuǎn)入新的PDA培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3d。重復(fù)此步驟2～3次以更好活化泡盛曲霉菌種，讓菌種逐漸適應(yīng)環(huán)境。

1.2.2 泡盛曲霉的紫外誘變

1.2.2.1 泡盛曲霉孢子懸液最佳誘變濃度

用滅菌生理鹽水15mL將斜面培養(yǎng)基上的泡盛曲霉孢子沖洗到平皿中，得到泡盛曲霉孢子懸液，取1mL孢子懸液用血球計數(shù)板計數(shù)，對孢子懸液進(jìn)行梯度稀釋 1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5。每種濃度取5mL放入平皿中，置于磁力攪拌器上，在20W紫外燈下，距離30cm，避光照射30S。

取0.1mL照射后的不同孢子濃度的懸液涂布于PDA培養(yǎng)基，用牛皮紙將培養(yǎng)皿包好，在恒溫培養(yǎng)箱中暗光條件24℃培養(yǎng)24h，將牛皮紙取下繼續(xù)在24℃培養(yǎng)24h后取出計數(shù)。

1.2.2.2 泡盛曲霉孢子懸液適宜濃度下進(jìn)行紫外突變

將長滿泡盛曲霉孢子的PDA斜面培養(yǎng)基用15mL滅菌生理鹽水得泡盛曲霉孢子懸液，取1mL懸液放在血球計數(shù)板上計數(shù)，用滅菌生理鹽水稀釋剩余14mL孢子懸液至適宜濃度，取5mL放入平皿中，置于磁力攪拌器上，在20W紫外燈下，距離30cm，避光照射30S。

1.2.3 突變菌株篩選與傳代

1.2.3.1 突變菌株的篩選

取1mL照射后的孢子懸液涂布于剛果紅培養(yǎng)基上，制備50個平板，用牛皮紙將培養(yǎng)皿包好，暗光條件24℃培養(yǎng)24h，將牛皮紙取下繼續(xù)在24℃培養(yǎng)48h。培養(yǎng)完成后，選取出現(xiàn)透明圈的菌落，然后對菌落直徑大小、透明圈直徑大小進(jìn)行一一測量，選取透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌落，挑取菌落接種在PDA培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中24℃培養(yǎng)3d。

1.2.3.2 突變菌株傳代培養(yǎng)

將篩選得到的突變菌株經(jīng)培養(yǎng)后，接種在新的PDA培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中24℃培養(yǎng)3d以穩(wěn)定突變后性狀。

1.2.4 液體培養(yǎng)

用10mL滅菌生理鹽水分別將突變前的菌落與突變后的菌落上的孢子洗脫下來，取1mL孢子懸液放在血球計數(shù)板上計數(shù)，將兩組孢子懸液稀釋至相同濃度，取2mL孢子懸液并分別接種在滅菌50mL馬鈴薯羧甲基纖維素液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中100rpm24℃培養(yǎng)24h，獲取發(fā)酵液。

1.2.5 DNS法測發(fā)酵液中還原糖含量

利用羧甲基纖維素能夠被纖維素酶分解成還原糖這一特性，用馬鈴薯浸出液與羧甲基纖維素配制液體培養(yǎng)基，用DNS法測定菌株的液體培養(yǎng)基發(fā)酵液還原糖量來比較泡盛曲霉突變前后分解纖維素的能力。

1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL分別加入試管中，加入蒸餾水至1mL，再分別加入DNS試液2mL，沸水浴2min，冷卻，定容至15mL，540nm測定各管吸光度。

1.2.5.2 菌株發(fā)酵液葡萄糖濃度測定：取發(fā)酵液10mL，5000rpm離心5min，取上清液1mL加入9mL蒸餾水制備稀釋液。取1mL稀釋液加入2mLDNS試劑，搖勻，沸水浴2min，冷卻，定容至15mL，540nm測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡盛曲霉孢子最佳誘變濃度的確定

經(jīng)過對梯度稀釋的泡盛曲霉孢子懸液進(jìn)行紫外誘變得到最佳誘變孢子懸液稀釋倍數(shù)1×10-3，如表1所示。各種微生物對紫外誘變的紫外線計量、照射時間、照射距離、溫度、pH值及微生物濃度都不相同，需要試驗來確定最佳的突變因素，紫外線計量的大小直接影響著菌體突變率，但是紫外線計量大會曾加菌體死亡，太小不會成功誘變。所以需要對各種因素進(jìn)行實驗，以達(dá)到最佳誘變的因素。在紫外誘變過程中需要在無光或紅光條件下進(jìn)行，乃至初期培養(yǎng)需要在避光條件下進(jìn)行，防止光復(fù)活作用，導(dǎo)致紫外突變結(jié)果不明顯。如果用紫外線直接誘變泡盛曲霉菌絲體，會導(dǎo)致其突變性狀在傳代過程中消失，突變效果不明顯，故用其孢子體進(jìn)行紫外誘變，能夠有效的改變這一問題。

在稀釋倍數(shù)1×10-4與1×10-5下進(jìn)行紫外誘變，菌株存活為0，是因為孢子濃度低，導(dǎo)致在紫外線作用下全部被殺死；稀釋倍數(shù)1×10-1和1×10-2下，孢子濃度太高，突變率低，同時菌株太多不利于后期篩選工作，故選稀釋倍數(shù)用1×10-3下進(jìn)行紫外誘變。

表1 孢子濃度稀釋倍數(shù)與存活菌量

對稀釋倍數(shù)用1×10-3計數(shù)得到結(jié)果為1.6×103個/mL。

2.2 突變菌株的篩選結(jié)果

突變前菌株透明圈有菌落大小比值為1.102。對泡盛曲霉孢子進(jìn)行紫外誘變，并對突變菌株的透明圈與菌落大小一一測量，產(chǎn)生正突變菌株共計61株，其中比值最大為1.403，為41號菌落。41號菌落具有透明圈與菌落大小比值比原菌落比值大的優(yōu)點，且菌落大小也比原菌落大，說明其繁殖能力強(qiáng)，產(chǎn)纖維素酶量高，其分解纖維素能力強(qiáng)，故選擇41號突變菌株作為以下試驗用菌株。如圖2所示。但是僅對其透明圈與菌落大小的比值還不足以說明其分解纖維素能力比原菌落高，需要對兩種菌株分解纖維素能力進(jìn)行對比，才能得出結(jié)論。

2.3 發(fā)酵液中還原糖含量

用DNS法測還原糖含量,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，y=0.5467x-0.0102，R2=0.9982。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 測定發(fā)酵液中還原糖濃度

分別測量突變前菌株與突變菌株的發(fā)酵液吸光度值，如表2所示。通過DNS法測定原菌落與突變菌落發(fā)酵液中羥甲基纖維素被纖維素酶分解產(chǎn)生的還原糖進(jìn)行對比，突變菌落發(fā)酵液中還原糖含量為0.61mg/mL，突變前菌落酵液中還原糖含量為0.32mg/mL。由于兩組所用的液體培養(yǎng)基采用相同的配制方法，同一批次，培養(yǎng)時間、溫度、光強(qiáng)等條件相同，說明突變菌株比突變前菌株分解纖維素能力明顯提高。

表2 突變前菌株與突變菌株吸光度值對應(yīng)的葡萄糖濃度

3 結(jié)論

3.1 孢子懸液的濃度對紫外誘變的效果有著至關(guān)重要的影響。本試驗結(jié)果表明孢子懸液濃度為1.6×103濃度下，紫外誘變的條件為在20W紫外燈下，距離30cm，避光照射30S紫外誘變效果最佳，試驗中僅對6個不同梯度稀釋的孢子懸液進(jìn)行紫外誘變，紫外誘變的紫外線計量、照射時間、照射距離、溫度、pH值等因素尚有待進(jìn)一步探究。

3.2 通過對泡盛曲霉孢子進(jìn)行紫外突變共產(chǎn)生61株突變菌株，其中41號菌株與突變前菌株和其它突變菌株相比透明圈直徑與菌落直徑比最大，而且菌體生長力強(qiáng)。

3.3 通過對比突變前后兩組發(fā)酵液中還原糖含量可知，突變菌株發(fā)酵液中還原糖含量明顯比原菌株發(fā)酵液含量高。說明突變菌株分解纖維素能力比突變前菌株分解能力強(qiáng)，紫外誘變對于泡盛曲霉產(chǎn)纖維素酶菌株選育是一種有效改良技術(shù)。