一株雞源新城疫病毒的分離鑒定

王 昊，孫德君

（哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱 150000）

新城疫病毒屬于副黏病毒科、副黏病毒屬中的一個種。該病毒主要危害雞和火雞，在被侵襲的雞群中迅速傳播，強毒株可使雞群全群毀滅。弱毒株僅引起雞群呼吸道感染和產蛋量下降。該病毒是一種有囊膜的單股、負鏈RNA 病毒。病毒粒子具多形性，一般呈近似球形，直徑100～300 nm，有時也可呈長絲狀[1-3]。包膜為雙層結構膜，由宿主細胞外膜的脂類與病毒糖蛋白結合衍生而來。包膜表面有長12～15 nm 的刺突，具有血凝素、神經氨酸酶。病毒的中心是蛋白質衣殼粒，纏繞成螺旋對稱的核衣殼，直徑約18 nm。成熟的病毒是以出芽方式釋放至細胞外。其對外界環境的抵抗力較強，55 ℃作用45 min 和直射陽光下作用30 min 才被滅活。病毒可在4 ℃中存放幾周，在-20 ℃中存放幾個月或在-70 ℃中存放幾年，其感染力均不受影響。在新城疫暴發后8 周之內，仍可在雞舍、蛋巢、蛋殼和羽毛中分離到病毒[4-5]。新城疫病毒對乙醚、氯仿敏感。大多數常用消毒劑能將其迅速滅活。氫氧化鈉等堿性物質對其消毒效果不穩定。來蘇爾3%～5%、酚和甲酚5 min內可將裸露的病毒粒子滅活。在37 ℃的孵卵器內，用0.1%福爾馬林熏蒸6 h即可將其滅活。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料

病料采自湖北某養殖廠病死雞的肝臟、肺臟、脾臟。

1.1.2 病毒及血清

雞新城疫病毒La Sota 株，購自中國獸醫藥品監察所。雞新城疫標準陽性血清和禽流感標準陽性血清（H5、H9），購自中國獸醫藥品監察所。

1.1.3 雞胚

10日齡SPF雞胚，由哈藥集團生物疫苗有限公司提供。

1.1.4 紅細胞

健康雞紅細胞，由哈藥集團生物疫苗有限公司質量管理部提供。

1.1.5 主要試劑

提取核酸試劑盒，TaKaRa MiniBEST Viral RNA∕DNA Extraction Kit Ver 5.0。

1.1.6 主要試驗器材

脈動真空滅菌器（山東新華醫療器械股份有限公司，XG1.1型）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海福瑪實驗設備有限公司，DGX-9623BC-1 型）；數顯電熱恒溫培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠，HPX-9162 MBE 型）；PCR 儀（美國BIO-RAD公司，S1000型）；ChemiDoc XRS凝膠成像系統（美國BIO-RAD 公司，ChemiDoc RAD 型）；生物潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司，BCM-1300A型）；冷凍高速離心機（賽默飛世爾科技（中國）有限公司，Lengend Micro 21R）；電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，AL204-IC型）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病料處理

取出病死雞的肝臟、肺臟和脾臟，放入滅菌容器中，加入PBS 液10 mL 進行研磨，然后放入-20 ℃反復凍融3次，3 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，加青霉素、鏈霉素使其濃度為1 000 U·mL-1，4 ℃過夜后置-20 ℃保存備用。

1.2.2 雞胚的接種傳代

取10 日齡雞胚5 枚，用1 mL 注射器吸取處理好的病毒上清液，尿囊腔接種雞胚（0.2 mL·胚-1），37 ℃恒溫培養箱培養120 h，24 h 進行照胚，將24 h內的死亡雞胚棄去，收集48～120 h內死亡的雞胚，觀察病變，同時無菌收集尿囊液，雜檢后放入-20 ℃冰箱保存備用。按照以上方法連續傳3代，收集第3代的尿囊液進行鑒定。

1.2.3 血凝抑制實驗

按現行《中國獸藥典》規定的方法進行紅細胞凝集試驗（微量法），測定無菌收集尿囊液的血凝價，再用NDV 陽性血清和AIV（H5、H9）陽性血清進行血凝抑制實驗。

1.2.4 血清中和實驗

將分離株的雞胚尿囊液分別用滅菌生理鹽水稀釋1 000 倍，各取1 mL 病毒稀釋液分別與等量10 倍稀釋的新城疫標準陽性血清和AIV 標準陽性血清充分混勻后于37 ℃作用1 h，同時設置上述滅菌生理鹽水稀釋1 000 倍尿囊液作為對照組，每組接種10 日齡SPF 雞胚5 只，每胚接種0.1 mL，37 ℃孵育，接種后每天照蛋2 次，觀察120 h。死胚隨時取出，置4 ℃冰箱。測定所有雞胚尿囊液的血凝價。

1.2.5 分離病毒EID50測定

將第3代病毒尿囊液做10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-8 3個稀釋度，各尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0.1 mL，置37 ℃繼續孵育。棄去24 h 死亡的雞胚，接種48～120 h 死亡的雞胚隨時取出，至120 h，取出所有活胚，逐枚收獲雞胚液，分別測定紅細胞凝集價，凝集價≥1：128 者判為感染，按Reed-Muench法計算EID50[6]。

1.2.6 PCR引物的設計與合成

參照GenBank 上已發表的NDV 的F 基因序列，用Primer 5.0軟件設計相應的特異性引物，用于擴增F基因重要功能區序列，其中上游引物F1：5'-TGTA GTAACGGGAGACAAAGCAG-3'；下游引物F2：5'-GAATAAATACCAGGAGACATAGGGA-3'。預計擴增出350 bp的F基因序列。引物交吉林庫美生物科技有限公司合成，合成的引物用1 mL·L-1DEPC（焦碳酸二乙酯）處理水稀釋至終濃度為20 μmol·L-1，-20 ℃保存備用。

1.2.7 病毒RNA的提取及PCR檢測

參考TaKaRa MiniBEST Viral RNA∕DNA Extraction Kit 說明書對雞胚尿囊液進行病毒基因組RNA的提取，其具體步驟如下：取200 μL 病毒原液，加入200μL的Buffer VGB，20μL的Proteinase K和1μL 的Carrier RNB，充分混合均勻56 混水浴溫浴10 min。然后向裂解液中加入200μL無水乙醇，充分吸打均勻。將Spin Column 安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12 000 r·min-1離心2 min，棄濾液。將500μL 的buffer RWA 加入至Spin Column 中，12 000 r · min-1離心1 min，棄濾液。將700μL 的buffer RWB 加入至Spin Column中12 000 r·min-1離心1 min，棄濾液。重復操作該步驟1次。將Spin Column安置于collection Tube上，12 000 r · min-1離心2 min。將Spin Column 安置于新的1.5 mL RNase free collection tube 上，在Spin Column膜的中央加入35 mL的RNase free dH2O，室溫靜置5 min。12 000 r·min-1離心2 min 洗脫病毒RNA。將下液重新加入到Spin Column 膜的中央，室溫靜置2 min 后，12 000 r·min-1離心2 min 洗脫病毒RNA。

按照Easy Script First-Stand cDNA Synthesis Super Mix反轉錄試劑盒的說明將RNA反轉錄成cDNA，其具體步驟如下：取14.5μL上述提取所得的RNA，加入2μL 的Oligo（隨機引物），充分混勻于70 ℃水浴5 min，然后置于-20 ℃反應5 min。像上述反應液中加入5 μL 的5×Buffer、2 μL 的dNTP、0.5μL的RNAi和1μL的mLV，充分混勻于37 ℃水浴1 h。將上述反應液于95 ℃水浴5 min，終止反應，獲得cDNA。

以cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系為：

F 片段反應程序：混勻后，稍微離心，95 ℃5 min，預變性后，進行下列循環反應。

94 ℃ 50 s 變性

49 ℃ 50 s 退火

72 ℃ 1 min 延伸

35個循環后72 ℃延伸10 min。

1.2.8 凝膠電泳

PCR 產物用15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測（將配置好的15 g · L-1瓊脂糖凝膠，熔化后倒入已封好、插入樣品梳的電泳槽中，冷卻凝固后拔出樣品梳，用微量移液器取所得PCR 產物10μL 于15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，條件為100 V、0.02 mA，電 泳15 min，觀察所擴增片段）。將瓊脂糖溶液（15 g·L-1）倒入制膠模中，然后在適當位置處插上梳子。凝膠厚度一般為3～5 mm。倒入30 mL 瓊脂糖 溶液。

在室溫下使膠凝固，約30 min。取適量PCR產物與6×上樣緩沖液混勻用微量移液槍小心加入樣品槽中。上樣量根據樣品濃度可適當調整， 若DNA 含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量（一般小孔40μL 為上限，大孔200 μL 為上限，具體和制膠膜規格 相關）。每加完一個樣品要更換槍頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。加完樣后，合上電泳 槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?10 V， 電流＞40 mA。當條帶移動到距凝膠前沿約2 cm 時（約40 min），停止電泳。紫外光下拍照并觀察。

2 試驗結果

2.1 病毒的分離

接種的雞胚在48～96 h 有死亡雞胚，解剖后發現死亡雞胚和正常雞胚相比發育較小，整個胚體充血，在頭、頸、腹、背、翅和趾部有出血點，尤其頸部非常明顯。

2.2 血凝和血凝抑制結果

該毒株具有血凝性，血凝效價為7～8。病毒株的血凝性可被NDV 的陽性血清所抑制，但不能被禽流感病毒的陽性血清所抑制從而可以判定分離的毒株為NDV毒株。

2.3 分離毒的EID50結果

分離毒的EID50結果為107.83·0.1 mL-1。

2.4 病毒PCR鑒定結果

用瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產物進行檢測，結果分離毒株在約350 bp 處均可見到清晰的目的條帶，見附圖，與預期結果相符。

附圖 HB1910株PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

3 討 論

本試驗在發病雞群中分離到一株病毒，能與雞紅細胞發生凝集反應，可被新城疫標準陽性血清所抑制，不能被禽流感標準陽性血清所抑制，從而判定該病毒為雞新城疫病毒。本試驗為發病雞場更準確的找到了雞群發病的原因，可針對此原因制定綜合防治措施。

新城疫的防治主要通過疫苗免疫接種，制定科學合理的免疫程序對新城疫的防控至關重要。免疫雞群也可以發生新城疫病毒感染，往往由于母源抗體干擾免疫效果導致免疫失敗。因此，新城疫疫苗免疫要掌握好免疫時機，避開母源抗體高峰期，一般可以對雞群的母源抗體效價進行監測，如果抗體效價高于25則不產生免疫應答，在23的時候免疫接種可以產生良好的免疫效果。

新城疫病毒是家禽最常見的病毒性傳染病，各種家禽普遍易感，各種年齡雞都可感染，幼雞和雛雞更易感。本病春秋兩季高發，雞群一旦發生強毒感染，一般很難凈化。平時需要做好養殖場的環境衛生，保持雞舍的溫度，通風良好，一旦發生患病雞要及時隔離。此外，防治新城疫要采取嚴格的生物安全措施，加強引種方面的監管，防止新城疫強毒進入家禽群，做好定期的免疫接種工作，提高禽群特異性免疫效果。