熱打擊通過活化NLRP3炎性小體增加肺毛細(xì)血管的通透性

莊小壘，李俊嶺，李茜汝，丁洪光

熱射病是高溫環(huán)境或高強(qiáng)度體力勞動引起的、以核心體溫大于40 ℃、多器官功能損害為主要臨床表現(xiàn)的急危重癥［1］。如未得到及時(shí)的救治，熱射病患者將很快出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）和急性肝、腎功能障礙等多器官的功能損傷，病死率極高［2］。ARDS是熱射病的常見并發(fā)癥，其主要病理特征為肺微血管通透性增加，血?dú)馄琳瞎δ芷茐模^多的液體從肺毛細(xì)血管滲漏到肺泡腔中，引起肺水腫及呼吸衰竭［3］。

肺部過度炎癥反應(yīng)是ARDS發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，而 NLRP3 炎性小體是 ARDS 發(fā)病的核心［4］。NLRP3 炎性小體作為細(xì)胞內(nèi)的模式識別受體，參與白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的剪切成熟，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分［5］。熱打擊能否通過活化NLRP3炎性小體上調(diào)肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中IL-1β 表達(dá)，誘導(dǎo)緊密連接蛋白（claudin-5、occludin、ZO-1）表達(dá)的下調(diào)，尚鮮見報(bào)道。本研究旨在探討熱打擊通過活化NLRP3 炎性小體下調(diào)肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料 雄性清潔級C57BL/6 小鼠，鼠齡6～8 周，共24 只，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；原代大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；IL-1β抗體購自美國Chemicon International 公司；半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）-1 抗體、CD31 抗體、claudin-5 抗體、occludin 抗體及 ZO-1 抗體購自英國 Abcam 公司；β-actin 抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司，活性氧（ROS）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物（TEMPO）購自美國Enzo lifes cienccs 公司；ZVAD-FMK（caspase 抑制劑）購自美國ApexBio 公司；IL-1 受體拮抗劑（IL-1Ra）購自美國Med Chem Express 公司；Western blot 二抗購自美國 Cell Signaling Technology 公司；免疫熒光二抗購自美國Invitrogen Life Technologies 公司；總蛋白提取試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自美國Bioworld Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 動物處理和分組 用隨機(jī)數(shù)字表對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行完全隨機(jī)化分組，分組包括：對照組和熱打擊組，每組12 只小鼠。對照組小鼠置于溫度（25.0±0.5）℃、相對濕度35%±5%的環(huán)境下；熱打擊組置于艙內(nèi)溫度（35.5±0.5）℃、相對濕度60%±5%的仿真高溫艙內(nèi)，每隔30 min 測肛溫，當(dāng)達(dá)肛溫41 ℃時(shí)，每隔10 min測1次，當(dāng)肛溫達(dá)42 ℃時(shí)即停止熱打擊，移至溫度（25.0±0.5）℃，相對濕度35%±5%的環(huán)境下復(fù)溫24 h。

1.2.2 細(xì)胞處理和分組 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞用20%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，在37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用隨機(jī)數(shù)字表對實(shí)驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)行完全隨機(jī)化分組，分組包括：對照組、熱打擊組、熱打擊+TEMPO 組、熱打擊+Z-VAD-FMK 組、熱打擊+IL-1Ra 組，每組4 例。對照組：37 ℃培養(yǎng)。熱打擊組：42 ℃熱暴露2 h 后37 ℃復(fù)溫培養(yǎng)24 h。熱打擊+TEMPO 組：熱打擊前，用TEMPO（ROS 清除劑，100 U/mL）預(yù)處理。熱打擊+Z-VADFMK 組：熱打擊前，用Z-VAD-FMK（10 μmol/L）預(yù)處理。熱打擊+IL-1Ra組：熱打擊前，用IL-1Ra（40 μg/L）預(yù)處理。

1.2.3 肺組織ROS 檢測 按ROS 檢測ELISA 說明書將小鼠肺組織進(jìn)行處理；加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品各50 μL于反應(yīng)孔后，加入50 μL生物素標(biāo)記的抗體，37 ℃孵育l h；洗滌液3次；加入親和鏈酶素-HRP 80 μL/孔，37 ℃孵育30 min；洗滌液3次；加入底物A、B 50 μL/孔，37 ℃孵育10 min；加入終止液50 μL/孔，測定各孔在450 nm 波長處的光密度（OD）值，并計(jì)算樣品濃度。

1.2.4 細(xì)胞ROS檢測 制作肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞玻璃爬片，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，給予37 ℃或42 ℃培養(yǎng)；取無血清DMEM高糖培養(yǎng)基以1∶1 000 稀釋2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFHDA），使其終濃度為10 μmol/L；干預(yù)結(jié)束后，吸除舊培基，用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基洗滌2遍，每孔加入2 mL稀釋后的DCFH-DA工作液，孵育30 min；無血清DMEM高糖培養(yǎng)基洗滌3次，置于熒光顯微鏡下拍照。

1.2.5 Western blot檢測 IL-1β、caspase-1、claudin-5、occludin、ZO-1 蛋白表達(dá) 按總蛋白提取試劑盒說明書提取肺組織和細(xì)胞總蛋白。干預(yù)結(jié)束后吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基并用PBS漂洗；加入總蛋白提取液，冰上刮取細(xì)胞；低溫高速離心后取上清即為提取的蛋白。用BCA 蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度，用組織裂解液把各組蛋白調(diào)整到同一濃度。100 ℃煮沸變性蛋白后按順序?qū)⒌鞍讟悠芳尤肷蠘涌字校M(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。結(jié)束電泳后，將凝膠中的蛋白通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜上；用5%脫脂奶粉封閉1 h；將PVDF膜裁剪后分別放入IL-1β（1∶1 000）、caspase-1（1∶1 000）、claudin-5（1∶1 000）、occludin（1∶1 000）、ZO-1（1∶1 000）、β-actin（1∶3 000）抗體工作液中，4 ℃孵育過夜；第2 天室溫孵育二抗1 h 后，ImageQuant LAS 500 顯影儀曝光顯影，F(xiàn)luorChem 8900 軟件分析各條帶灰度值。

1.2.6 免疫熒光檢測caspase-1、IL-1β表達(dá) 制作肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞玻璃爬片，干預(yù)結(jié)束后吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基并用PBS漂洗；4%多聚甲醛固定爬片20 min；5%BSA 室溫封閉30 min；加入一抗caspase-1（1∶100）、IL-1β（1∶100）和CD31（1∶100），4 ℃條件下孵育過夜；第2 天加入二抗（1∶100），室溫條件下孵育1 h；用抗熒光淬滅封片劑封片；置于熒光顯微鏡下拍照。

1.2.7 伊文氏藍(lán)檢測小鼠毛細(xì)血管滲漏 各組小鼠在干預(yù)結(jié)束后，從股靜脈以2 mg/kg 劑量注射2%伊文氏藍(lán)溶液；在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)用生理鹽水于右心室進(jìn)行灌注，直至經(jīng)右心耳流出無色透明液體時(shí)，停止灌注；分離肺組織后，按1 mL/100 mg加入甲酰胺溶液，60 ℃水浴抽提2 h，于酶標(biāo)儀620 nm處測吸光度（A）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算肺組織伊文氏藍(lán)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均由SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件完成，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組數(shù)據(jù)間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組數(shù)據(jù)間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熱打擊導(dǎo)致小鼠肺毛細(xì)血管通透性增加 熱打擊組小鼠肺組織伊文氏藍(lán)濃度明顯高于對照組［（127.5±13.2）mg/gvs.（46.8±7.9）mg/g，n=4，t=10.500，P＜0.01］。

2.2 熱打擊上調(diào)小鼠肺組織ROS 的表達(dá) 熱打擊組小鼠肺組織ROS 表達(dá)水平明顯高于對照組［（3 284.0±601.8）U/mLvs.（1 492.5±305.3）U/mL，n=4，t=5.309，P＜0.01］。

2.3 熱打擊促進(jìn)小鼠肺組織NLRP3 炎性小體活化和IL-1β 表達(dá) 與對照組比較，熱打擊組小鼠肺組織caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)水平升高，見圖1。

Fig.1 Heat stress enhanced the activation of NLRP3 inflammasome and upregulated IL-1β in lung tissue圖1 熱打擊促進(jìn)肺組織NLRP3炎性小體活化和IL-1β表達(dá)

2.4 熱打擊下調(diào)小鼠肺組織緊密連接蛋白的表達(dá) 與對照組比較，熱打擊組小鼠肺組織緊密連接蛋白ZO-1、occludin 和claudin-5 表達(dá)水平明顯降低（均P＜0.01），見圖2。

2.5 熱打擊上調(diào)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS 的表達(dá) 與對照組比較，熱打擊組肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞綠色熒光的表達(dá)強(qiáng)度（ROS的表達(dá)）明顯升高，見圖3。

Fig.2 Heat stress downregulated tight junction proteins in lung tissue圖2 熱打擊下調(diào)肺組織緊密連接蛋白的表達(dá)

Fig.3 Reactive oxygen levels in pulmonary microvascular endothelial cells(×200)圖3 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS水平（×200）

2.6 熱打擊促進(jìn)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3 炎性小體活化 Western blot 結(jié)果顯示，熱打擊后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞caspase-1 蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.01）；用TEMPO清除ROS后，熱打擊后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞caspase-1 表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01），見圖4A、B。免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組比較，熱打擊后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞紅色熒光的表達(dá)強(qiáng)度（caspase-1 的表達(dá)）明顯升高；用TEMPO 清除ROS 后，熱打擊后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞紅色熒光的表達(dá)強(qiáng)度明顯下降，見圖5。

Fig.4 Heat stress enhanced the activation of NLRP3 inflammasome in pulmonary microvascular endothelial cells圖4 熱打擊促進(jìn)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎性小體活化

Fig.5 Heat stress enhanced the activation of NLRP3 inflammasome in pulmonary microvascular endothelial cells圖5 熱打擊促進(jìn)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎性小體活化

2.7 熱打擊上調(diào)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β 表達(dá) Western blot 結(jié)果顯示，熱打擊后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β 蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.01）；用 Z-VAD-FMK 阻斷 caspase-1 的作用，熱打擊后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01），見圖6A、B。免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組比較，熱打擊后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞紅色熒光的表達(dá)強(qiáng)度（IL-1β的表達(dá)）明顯升高；用Z-VAD-FMK阻斷caspase-1的作用后，熱打擊后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞紅色熒光的表達(dá)強(qiáng)度明顯下降，見圖7。

Fig.6 Heat stress upregulated IL-1β in pulmonary microvascular endothelial cells圖6 熱打擊上調(diào)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β表達(dá)

Fig.7 Heat stress upregulated IL-1β in pulmonary microvascular endothelial cells圖7 熱打擊上調(diào)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β表達(dá)

2.8 熱打擊可下調(diào)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá) 熱打擊后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1、occludin 和claudin-5 表達(dá)水平明顯低于對照組（P＜0.01）；用IL-1Ra 阻斷IL-1β 的作用，熱打擊后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)水平明顯上升（P＜0.01），見圖8。

3 討論

3.1 熱打擊通過下調(diào)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)增加肺毛細(xì)血管的通透性 肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞是血?dú)馄琳系闹匾M成部分，其在毛細(xì)血管內(nèi)形成連續(xù)的單細(xì)胞層［6］，并且血管內(nèi)皮細(xì)胞之間形成牢固的細(xì)胞連接，在細(xì)胞間隙形成屏障［7］，有效地控制血管內(nèi)皮對細(xì)胞、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的通透性。血管內(nèi)皮細(xì)胞間連接主要包括緊密連接和黏附連接［8］。緊密連接中claudin-5主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺微循環(huán)［9］。有研究表明claudin-5表達(dá)上調(diào)增強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能［10］。occludin 是緊密連接功能和穩(wěn)定性的重要調(diào)節(jié)器，與claudin之間相互作用，參與形成血管內(nèi)皮的屏障功能［11］。ZO將緊密連接的跨膜蛋白與細(xì)胞骨架連接固定起來，絕大部分claudin是通過與ZO-1結(jié)合連接到細(xì)胞骨架上，因此ZO-1也參與形成血管內(nèi)皮細(xì)胞層的屏障功能［12］。可見，緊密連接蛋白對維持血?dú)馄琳贤暾灾陵P(guān)重要。熱打擊對ZO-1、occludin 和claudin-5 表達(dá)的影響，尚鮮見報(bào)道。本研究顯示，熱打擊后小鼠肺部伊文氏藍(lán)滲出明顯增多，伴隨ZO-1、occludin和claudin-5的表達(dá)下調(diào)，提示熱打擊后肺毛細(xì)血管的通透性增加與肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

3.2 熱打擊通過活化NLRP3 炎性小體下調(diào)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá) NLRP3炎性小體是由NOD-like受體家族蛋白NLRP3、轉(zhuǎn)換分子蛋白ASC 和半胱氨酸蛋白酶caspase-1 組成的功能性蛋白分子復(fù)合物［13］。研究表明，ROS可活化NLRP3炎性小體，使caspase-1 前體（pro-caspase-1）轉(zhuǎn)化為caspase-1，后者通過剪切IL-1β 前體產(chǎn)生具有致炎活性的成熟體IL-1β［14］。熱打擊能否誘導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎性小體活化、上調(diào)IL-1β表達(dá)，進(jìn)而下調(diào) ZO-1、occludin 和 claudin-5 的表達(dá)，尚鮮見報(bào)道。本研究表明，熱打擊后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS 表達(dá)上調(diào)，同時(shí)伴隨NLRP3 炎性小體的活化（caspase-1 表達(dá)上調(diào)）、IL-1β 表達(dá)上調(diào)。用藥物清除ROS后，NLRP3炎性小體的活化被阻斷（caspase-1 表達(dá)下調(diào)）；用藥物阻斷caspase-1 的作用后，可逆轉(zhuǎn)熱打擊所導(dǎo)致的IL-1β表達(dá)上調(diào)。提示熱打擊可通過上調(diào)ROS活化NLRP3炎性小體，進(jìn)而促進(jìn)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β的表達(dá)。為了驗(yàn)證熱打擊后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的IL-1β能否導(dǎo)致緊密連接蛋白表達(dá)的改變，本課題組用Western blot 檢測了claudin-5、occludin和ZO-1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)熱打擊后緊密連接蛋白表達(dá)水平明顯降低；用藥物阻斷IL-1β 的作用后，可逆轉(zhuǎn)熱打擊所導(dǎo)致的緊密連接蛋白的下調(diào)；提示熱打擊可通過活化NLRP3 炎性小體促進(jìn)IL-1β 的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白。有研究顯示，脂多糖（LPS）可刺激肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子（TNF）-α［15］，且細(xì)胞層兩側(cè)電阻率明顯下降［16］，內(nèi)皮通透性也明顯增加［17］。這些研究也側(cè)面證實(shí)了本文研究的結(jié)果。

Fig.8 Heat stress downregulated tight junction proteins in pulmonary microvascular endothelial cells圖8 熱打擊下調(diào)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)

3.3 本研究的局限性 本研究亦存在以下局限性：首先，在證明ROS/NLRP3 通路時(shí)，筆者采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)藥物阻斷的方法，基因敲除動物或基因干擾細(xì)胞的方法可能會進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；再次，本研究并未對熱打擊導(dǎo)致ROS表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制進(jìn)行探索，如能完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)，將進(jìn)一步增加本研究的可信度。

綜上所述，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是熱射病患者ARDS發(fā)生的重要原因。闡明熱打擊激活肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞上調(diào)炎癥因子表達(dá)的機(jī)制，可為熱射病患者ARDS的治療提供潛在靶點(diǎn)。本研究證實(shí)了熱打擊通過上調(diào)ROS 活化NLRP3 炎性小體，促進(jìn)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白，導(dǎo)致肺微血管通透性增加，為熱射病患者ARDS 的防治提供了理論依據(jù)。