液相色譜-串聯質譜法檢測豆瓣醬中的特丁基對苯二酚于剛

胡江濤 李永麗

摘要 [目的]建立豆瓣醬中特丁基對苯二酚（TBHQ）檢測的液相色譜-串聯質譜聯用分析方法。[方法]樣品中的TBHQ用甲醇提取，以C18作為分離柱，以電噴霧離子源在負離子檢測模式下多重反應監測（MRM）分析。[結果]方法的線性范圍為0.05～100.00 mg/L（r=0.999 1），方法的檢出限達0.25 mg/kg;回收率為80.9%～104.6%，RSD（n=5）≤8.3%。[結論]該方法能快速、簡便、靈敏、準確地檢測豆瓣醬中的TBHQ。

關鍵詞 液相色譜-串聯質譜聯用;檢測;TBHQ;豆瓣醬

中圖分類號 TS207.3文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）19-0212-04

Abstract [Objective] The research aimed to establish a liquid chromatographytandem mass spectrometry（LCMS/MS） method for the determination of tertbutyl hydroquinone（TBHQ） in thick broadbean sauce.[Method] The TBHQ in the sample was extracted with methanol，and C18 was used as a separation column to analyze the multiple reaction monitoring（MRM） in the negative ion detection mode with an electrospray ion source.[Result]The linear range of the method was 0.05-100.00 mg/L（r=0.999 1），the detection limit was 0.25 mg/kg，and the recovery rates of TBHQ were 80.9%-104.6%，RSD was less than 8.3%.[Conclusion]The method can determine TBHQ in thick broadbean sauce quickly，conveniently，sensitively and accurately.

Key words LCMS/MS;Determination;Tertbutyl hydroquinone（TBHQ）;Thick broadbean sauce

特丁基對苯二酚（tertiary butylhydroquinone，TBHQ）是食品工業中廣泛使用的一種抗氧化劑，它可以提高食品的穩定性，特別適用于動植物脂肪以及富脂食品，但由于其具有潛在的毒性和致癌作用，為保護人體健康，我國明確規定了其在食品中的最大使用限量[1]。一些發達國家和地區出于維護本國經濟利益和保護人們健康的需要，對進口食品中TBHQ的殘留量等衛生指標提出了愈來愈嚴格的限量要求。尤其是日本尚未批準TBHQ作為抗氧化劑在食品中使用，要求輸日食品中不得含有TBHQ。

目前測定TBHQ的方法較多，主要有高效液相色譜法[2-6]、氣相色譜法[7]和氣相色譜-質譜法[8]等。其中高效液相色譜法是目前應用最多的一種檢測方法。這些方法主要針對油脂樣品中TBHQ的檢測，存在著樣品前處理過程復雜、耗時長、選擇性不好、靈敏度不高和檢出限偏高的問題，不能滿足準確、快速、簡便的檢測要求。

豆瓣醬是四川地區的特色產品之一，深受世界各地人們的喜歡，產品無論在國內還是國外均有較大的消費量。TBHQ是豆瓣醬質量監測的常檢項目之一。在實際檢測工作中發現，現行的標準方法不太適用于該類產品中TBHQ殘留量的檢測[9]。由于豆瓣醬基質較為復雜，檢測時會出現較大的干擾，影響定性判斷，極易出現假陽性結果。同時由于干擾較大，影響定量的準確性。該研究建立了快速、準確、簡便地檢測豆瓣醬中TBHQ的液相色譜-串聯質譜聯用法，并在實際工作中得到較好的應用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與裝置

液相色譜-串聯質譜聯用儀配ESI源（液相色譜，LC-30A，日本島津;串聯質譜儀，API4000，美國AB公司）;電子分析天平（XS205，梅特勒托利多儀器有限公司）;微型旋渦混合器（WH-3型，上海滬西分析儀器廠有限公司）;冷凍高速離心機（3-30K，Sigma，德國）;尼龍針式過濾頭（0.45 μm，天津津騰實驗設備有限公司）。

1.2 主要材料與試劑

甲醇、乙腈（ HPLC 級，Fisher Scientific，美國）;無水乙醇（分析純，北京北化精細化學品有限責任公司）;氨水（分析純，北京益利精細化學品有限公司）;冰乙酸（分析純，天津市化學試劑六廠）;超純水（Milli-Q integral 3，MILLIPORE公司，美國）;TBHQ標準樣品（純度980%，Dr.Ehrenstorfer公司，德國）。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件。色譜柱（SB-C18，150 mm×2.1 mm×3.5 μm，Agilent公司）;柱溫35 ℃;流速 0.3? mL/min;流動相為甲醇-水梯度洗脫（0～5 min，甲醇從10%升至90%;5～8 min，甲醇90%;8.0～8.5 min，甲醇從90%降為10%;8.5～12.0 min，甲醇10%）;進樣體積5 μL。

1.3.2 質譜條件。電噴霧（ ESI）負離子模式;選擇反應檢測（MRM）;母離子m/z 165，子離子m/z 149（碰撞能量CE，35 eV）和m/z 108（碰撞能量CE，30 eV）;霧化氣（氮氣）448.16 kPa;干燥氣（氮氣）448.16 kPa;氣簾氣103.42 kPa;溫度400 ℃。

1.4 樣品測定

取有代表性試樣（2.00±0.10） g，至50 mL離心管中，加入5? mL甲醇，旋緊蓋子，置于渦旋混勻器上混勻，5 000 r/min離心10 min。殘渣用5? mL甲醇重復提取一次，合并提取液。取上清液1.0 mL，0.45 μm過濾膜過濾，收集清液于進樣瓶中，用于液相色譜-串聯質聯用儀測定，外標法定量。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的選擇

TBHQ的質譜條件是通過針泵把濃度為1 mg/mL的TBHQ標準溶液注入質譜儀優化得到的。設置Q1為全掃描模式，掃描范圍m/z 100～200，在正離子模式下沒有觀察到豐度較強的質譜信號;負離子模式下可以觀察到較強的基峰m/z 165的質譜圖（圖1）。此基峰應為分子中失去H形成的[M-1]-型分子離子峰。TBHQ分子量為166，分子結構中含有2個羥基（-OH），具有弱酸性，易去質子化形成負離子，與質譜數據相吻合。Q1選擇m/z 165為母離子，Q3選擇全掃描模式掃描范圍m/z 30～170，施加一定的碰撞能量，可以得到二級質譜圖（圖2）。從圖2可以看出，母離子m/z 165 的二級質譜中除了母離子之外，主要的碎片離子為m/z 149，來自于叔丁基上甲基的斷裂丟失;另有主要的碎片離子為m/z 108，主要由于苯環上叔丁基的斷裂丟失而生成。

目前液相色譜-串聯質譜法檢測TBHQ的報道較少[10]，但使用液相色譜-串聯質譜法檢測時靈敏度較差。該研究中發現TBHQ對離子源的條件較為敏感，氣流、溫度、去簇電壓等參數需要仔細優化才能得到較好的靈敏度。一般情況下，離子源的溫度較高、氣流較大時，可以更好地去溶劑化，促進目標物的電離效率，從而提高靈敏度。TBHQ檢測時，離子源溫度對靈敏度影響最為關鍵，較低的溫度靈敏度最好。個人推測雖然電噴霧是一種軟電離方式不會直接破壞化合物結構，但TBHQ作為一種抗氧化劑，其自身穩定性較差，在高溫時發生降解從而影響檢測靈敏度。

2.2 色譜條件的選擇

液相色譜的條件一般分等度和梯度洗脫模式，只分析一種化合物時一般選擇等度分離模式。考慮到該方法中要檢測的豆瓣醬基質較為復雜，為避免干擾物在色譜柱上富集對分析產生干擾，該試驗中選擇了梯度洗脫模式，在方法中TBHQ的保留時間在5.3 min左右。

反相液相色譜流動相常用的有機相是甲醇和乙腈。在試驗中比較了甲醇和乙腈分別作為流動相，二者對試驗結果未產生明顯差異。綜合考慮（成本、毒性等），該研究選擇了甲醇作為流動相。

2.3 標準曲線和檢出限

以水為稀釋溶劑，配制TBHQ的質量濃度為0.05、0.50、1.00、20.00和100.00 mg/L的溶液，液相色譜-質譜重復測定3次，以待測物的質量濃度為橫坐標、待測物的峰面積為縱坐標，用最小二乘法進行回歸運算，標準曲線為y=0.893x（r=0.999 1）。

目前常用的高效液相色譜法、氣相色譜法和氣相色譜-質譜法的檢出限在0.5 mg/kg以上，該方法中檢出限可以達到0.25 mg/kg，優于上述方法的檢出限。高效液相色譜法、氣相色譜法和氣相色譜-質譜法采用梯度洗脫或程序升溫模式將TBHQ 峰與雜質峰分開，通常需要15 min 以上，且雜質的存在往往會干擾定性定量分析的準確性。該研究只需12 min即可完成分析，采用TBHQ的子離子m/z 149作為定量離子分析，子離子m/z 108為定性離子，以二者的豐度比值作為定性確證依據，符合法規要求。即使有雜質的情況下，也能準確地對目標物進行檢測。

2.4 方法的準確性和特異性

通過樣品中添加標準溶液后分析的方式考察方法的準確性。稱取15份豆瓣醬樣品，每份2 g，等分為3組。每組添加濃度分別為0.25、1.00和2.00 mg/kg，按照方法制樣和分析測定，計算回收率和變異系數，所得的數據見表1。

2.5 色譜柱及樣品提取條件的選擇

在液相色譜分離角度考慮，TBHQ對色譜柱的選擇不高，普通C18均可得到較好的峰形。但在實際檢測使用高效液相色譜分析時發現，不同類型的色譜柱帶來對目標物和干擾物不同的選擇性，同一個樣品在不同色譜柱下呈現出不同的干擾。因此檢測人員實際檢測時可以通過更換不同的色譜柱對疑似樣品復檢確認，以得到更準確的結果。

該研究中采用串聯質譜作為液相色譜的檢測器，由于質譜高度的選擇性，不需要考慮干擾物對目標物的影響。但不同色譜帶來的不同共洗脫物是否造成基質效應，需要在以后的工作中做進一步研究。該試驗中選用普通的窄徑色譜柱，其最佳流速同離子源接口更匹配，可以得到最佳的靈敏度。

油脂中TBHQ檢測常用提取溶劑有甲醇、乙腈、正己烷、環己烷等，凈化手段通常采用凝膠色譜（GPC）。該研究的目的就是建立簡便快速的檢測方法，以適應滿足實際樣品檢測尤其是高通量檢測的需要，因此采用了甲醇提取后直接進樣分析的方式。

2.6 實際樣品檢測

近兩年來，成都海關技術中心和食品安全檢測四川省重點實驗室一直把該研究中的方法作為TBHQ檢測的重要的輔助技術手段使用。該法不但適用于豆瓣醬的檢測，且在香辣醬、火鍋底料等也有較好的效果。檢測多批次樣品，均取得了滿意的效果。圖5是工作中使用液相色譜檢測時的疑似陽性樣品，通過LC-MS/MS確證為陰性。圖6是其樣品的標準添加色譜圖，進一步確證了LC-MS/MS檢測的準確性。圖7是實際檢測時遇到的陽性樣品，經LC-MS/MS定量確證。

3 結論

建立的豆瓣醬中TBHQ的液相色譜-串聯質譜檢測方法，處理簡單快捷，靈敏度高，適合大批樣品的高通量檢測。該方法定量的同時可以確證，極大降低了假陽性概率的發生，并在實際工作中取得了較為滿意的效果。

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