食用菌子實(shí)體采后軟化機(jī)制的研究進(jìn)展

丁樹(shù)東，李艷杰

（山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東淄博 255000）

食用菌（edible fungi）是食用真菌的簡(jiǎn)稱，指那些可供人類食用的大型真菌。近年來(lái)我國(guó)食用菌產(chǎn)量和產(chǎn)值不斷增加，截至2015 年，食用菌產(chǎn)業(yè)已成為繼糧食、蔬菜、果樹(shù)、油料之后的第五大產(chǎn)業(yè)[1]。食用菌味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，與其他果蔬等植物性食品相比，具有蛋白質(zhì)、多糖、維生素含量高，脂肪含量低的特點(diǎn)[2]；且食用菌還有一定的生理活性功能，如抗腫瘤[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]和降脂保肝等作用，因此受到廣大消費(fèi)者的青睞。

食用菌采后進(jìn)行著許多復(fù)雜的生理變化及形態(tài)學(xué)變化，包括水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、風(fēng)味、色澤和質(zhì)地的變化等。其中子實(shí)體軟化一直是食用菌采后貯藏領(lǐng)域討論的焦點(diǎn)。而細(xì)胞壁組分的降解及結(jié)構(gòu)的改變被認(rèn)為是導(dǎo)致子實(shí)體質(zhì)地軟化的主要原因。本文通過(guò)綜述食用菌子實(shí)體老化過(guò)程中細(xì)胞壁組分的降解及結(jié)構(gòu)的改變、細(xì)胞壁降解酶與食用菌子實(shí)體軟化的關(guān)系，探討了食用菌子實(shí)體質(zhì)地軟化的機(jī)制，為進(jìn)一步研究食用菌貯運(yùn)、保鮮提供理論依據(jù)。

1 食用菌采后的主要生理變化

食用菌采后呼吸作用和蒸騰作用旺盛，是缺乏保護(hù)性的表皮結(jié)構(gòu)，因此極易受到機(jī)械損傷和微生物侵染，造成品質(zhì)下降。食用菌品質(zhì)的劣變是一個(gè)復(fù)雜的、多方面生理生化變化參與的綜合過(guò)程，包括細(xì)胞壁的變化、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗、呼吸作用和各種代謝過(guò)程。研究表明，室溫狀態(tài)下，食用菌在3～5 d 便會(huì)出現(xiàn)褐變、質(zhì)地變化、開(kāi)傘、菇柄伸長(zhǎng)、出現(xiàn)異味，在貯藏后期甚至出現(xiàn)自溶、腐爛等問(wèn)題，這些現(xiàn)象大大地降低了食用菌的食用價(jià)值和商品價(jià)值。其中，質(zhì)地變化是影響消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品接受性的重要因素[5]，主要表現(xiàn)為子實(shí)體硬度下降、后熟軟化。因此，子實(shí)體軟化一直是食用菌采后貯藏領(lǐng)域討論的焦點(diǎn)。

2 食用菌采后軟化機(jī)理

目前，研究發(fā)現(xiàn)采后食用菌軟化的原因大致分為細(xì)胞壁代謝[6]、活性氧代謝[7]和微生物侵染[8]等方面。其中，細(xì)胞壁代謝導(dǎo)致的細(xì)胞壁組分的降解及結(jié)構(gòu)的改變被認(rèn)為是子實(shí)體質(zhì)地軟化的主要原因。

2.1 細(xì)胞壁組分及結(jié)構(gòu)的變化

食用菌細(xì)胞壁是一個(gè)動(dòng)態(tài)的環(huán)境，具有一定的大小和強(qiáng)度，可以起到維持細(xì)胞形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、提供機(jī)械強(qiáng)度、維持滲透壓和細(xì)胞間信號(hào)介導(dǎo)等作用。與植物細(xì)胞壁不同，植物細(xì)胞壁以纖維素和果膠成分為主，真菌細(xì)胞壁主要是由中性多糖、幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)組成[9]，通常不含有果膠物質(zhì)[10]。不同類型真菌所含細(xì)胞壁多糖類型不同，低等真菌細(xì)胞壁多糖以纖維素為主，而包含大部分食用菌在內(nèi)的高等真菌細(xì)胞壁多糖則以幾丁質(zhì)為主[11]。食用菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)獨(dú)特，由葡聚糖（主要為β-1，3 葡聚糖、β-1，6 葡聚糖、α-1，3 葡聚糖等）、幾丁質(zhì)、糖蛋白和交聯(lián)蛋白組成的多層復(fù)雜組織[12]。在采后軟化過(guò)程中，食用菌細(xì)胞壁組分降解，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，此時(shí)細(xì)胞壁聚合物的溶解度上升[13]，這導(dǎo)致細(xì)胞塌陷，組織結(jié)構(gòu)松散，最終使食用菌質(zhì)地品質(zhì)下降。

2.1.1 細(xì)胞壁多糖

（1）細(xì)胞壁葡聚糖

葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的主要成分，約占真菌細(xì)胞壁干質(zhì)量的50%～60%[14]。真菌細(xì)胞壁中大多數(shù)葡聚糖以帶有β-1，6 分支的β-1，3-D-葡聚糖骨架為主鏈的，通過(guò)β-1，3-糖苷鍵連接形成的葡萄糖分子聚合物[15]，少部分葡聚糖是通過(guò)β-1，6、β-1，3/-1，4、β-1，4 糖苷鍵連接形成的。β-1，3 葡聚糖為螺旋狀微纖維結(jié)構(gòu)，是食用菌細(xì)胞壁葡聚糖的主要成分，它可以同其他細(xì)胞壁成分共價(jià)交聯(lián)形成復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，賦予細(xì)胞壁一定的彈性和張力[16]。而β-1，6 葡聚糖同樣是真菌細(xì)胞壁的重要組成成分。與β-1，3 葡聚糖相比，β-1，6 葡聚糖鏈較短，可以形成交聯(lián)的無(wú)定形結(jié)構(gòu)，對(duì)釀酒酵母細(xì)胞壁基質(zhì)的形成發(fā)揮重要作用[17]。Jiang 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，氣調(diào)包裝處理可以顯著抑制采后香菇在軟化期間細(xì)胞壁葡聚糖含量的下降，并認(rèn)為貯藏期間被降解的細(xì)胞壁葡聚糖可作為機(jī)體代謝活動(dòng)碳水化合物的來(lái)源。Ni 等[19]發(fā)現(xiàn)，采后香菇的細(xì)胞壁葡聚糖含量隨貯藏期間延長(zhǎng)而下降，與此同時(shí)，主要細(xì)胞壁降解相關(guān)酶的活性得到增強(qiáng)，編碼與細(xì)胞壁降解相關(guān)酶的主要基因的表達(dá)水平也被上調(diào)。

（2）細(xì)胞壁幾丁質(zhì)

幾丁質(zhì)是維持食用菌細(xì)胞壁穩(wěn)定的主要結(jié)構(gòu)成分，含量相對(duì)較少。它是通過(guò)β-1，4 糖苷鍵連接的由N-乙酰氨基葡糖殘基組成的線性大分子聚合物，結(jié)構(gòu)與纖維素相似，具有高度結(jié)晶態(tài)且不溶于水[20]。真菌細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)最主要的存在形式為α-chitin[21]。細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)具有高強(qiáng)度的氫鍵，它連接的微纖維具有很強(qiáng)的張力，這對(duì)于維持細(xì)胞壁的完整性和硬度具有重要的作用[22]。Zivanovic[23]、李順?lè)錥24]、Jiang 等[18]發(fā)現(xiàn)貯藏期間食用菌硬度下降，但幾丁質(zhì)含量不斷升高，從而使得雙孢蘑菇保持一定韌性。

（3）細(xì)胞壁纖維素

纖維素是由β-D-葡萄糖殘基通過(guò)β-1，4-糖苷鍵連接成的線性聚合物組成的，纖維素分子之間通過(guò)氫鍵進(jìn)一步聚合形成含有結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形區(qū)的微纖絲[25]。纖維素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被細(xì)胞內(nèi)的水解酶降解，因此其在細(xì)胞壁中起著維持細(xì)胞形狀，提高細(xì)胞壁強(qiáng)度的骨架作用[26]。丁樹(shù)東等[27]研究發(fā)現(xiàn)，外源亞精胺處理可以抑制香菇纖維素含量的下降，他認(rèn)為纖維素含量與硬度呈正相關(guān)，這表明纖維素對(duì)食用菌質(zhì)地起著重要的作用。

2.1.2 細(xì)胞壁蛋白

細(xì)胞壁蛋白（cell wall proteins，CWPs）同樣是真菌細(xì)胞壁的重要成分，根據(jù)功能可分為細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白和細(xì)胞壁酶蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白主要功能包括維持細(xì)胞的形態(tài)，在細(xì)胞遷移和融合時(shí)介導(dǎo)粘附，保護(hù)細(xì)胞免受外來(lái)物質(zhì)的傷害、介導(dǎo)物質(zhì)的吸收，以及在細(xì)胞內(nèi)傳遞外界刺激誘導(dǎo)的信號(hào)、合成和重構(gòu)細(xì)胞壁組分等[28-29]。研究表明，采后食用菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)由于蛋白酶的作用而被降解為游離氨基酸，用于貯藏后期生理代謝活動(dòng)以及幾丁質(zhì)的合成[30]。

2.2 降解酶的變化

采后食用菌軟化過(guò)程中，細(xì)胞壁成分、結(jié)構(gòu)變化主要是通過(guò)各種細(xì)胞壁降解酶的協(xié)同作用發(fā)生的。一般認(rèn)為，食用菌細(xì)胞壁降解酶主要分為β-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶兩種。

2.2.1 β-葡聚糖酶

β-葡聚糖酶是指能夠降解β-1，6、β-1，3、β-1，3/-1，4、β-1，4 葡聚糖的水解酶的總稱。根據(jù)葡聚糖酶水解的糖苷鍵連接類型和對(duì)特異性底物水解作用方式，可以將β-葡聚糖酶分為外切β-葡聚糖酶和內(nèi)切β-葡聚糖酶。當(dāng)外切β-葡聚糖酶水解時(shí)，會(huì)從葡萄糖鏈非還原末端按順序逐個(gè)切下葡萄糖殘基，生成葡萄糖[31]；而當(dāng)內(nèi)切β-葡聚糖酶水解時(shí)，會(huì)在葡萄糖鏈表面任意位點(diǎn)隨機(jī)切開(kāi)糖苷鍵，生成一些小片段的寡糖[32]。目前，對(duì)β-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)與功能的研究多集中在酵母菌[33，34]、Corallococcus sp.[35]、Bispora sp.[36]等病原菌上，而食用菌領(lǐng)域研究較少，下面將著重介紹外切-β-1，3 葡聚糖酶、內(nèi)切-β-1，3 葡聚糖酶、內(nèi)切-β-1，6 葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶在食用菌采后貯藏中的功能。

（1）外切-β-1，3 葡聚糖酶

外切-β-1，3 葡聚糖酶是一種作用于1，3 糖苷鍵，切割葡聚糖鏈生成葡萄糖的多糖水解酶。目前已從釀酒酵母中克隆表征出3 種編碼外切-β-1，3 葡聚糖酶的基因，分別是exg1、exg2和ssg1[37]。exg1基因編碼兩種主要的胞外外切-β-1，3-葡聚糖酶[34]，exg2基因編碼附著于質(zhì)膜的外切-β-1，3 葡聚糖酶[38]，ssg1基因編碼孢子形成特異性外切-β-1，3-葡聚糖酶[39]。

在擔(dān)子菌類蘑菇中，關(guān)于編碼基因的外切-β-1，3-葡聚糖酶的信息很少。Sakamoto 等[40]純化并表征了來(lái)自香菇的外切-β-1，3-葡聚糖酶，命名為exg1。exg1是歸類于GH5 家族的β-1，3-葡聚糖酶，并且與雙孢蘑菇中的外切-β-1，3-葡聚糖酶序列具有高度相似性[41]。試驗(yàn)表明，exg1基因在子實(shí)體中特異性表達(dá)，但在營(yíng)養(yǎng)菌絲體中不表達(dá)，并且在采后下調(diào)；同時(shí)，exg1編碼蛋白可降解β-1，3-葡聚糖和昆布多糖，但不降解香菇多糖。這些觀察結(jié)果表明，exg1基因不參與香菇多糖降解或子實(shí)體衰老。另一方面，exg1基因在生長(zhǎng)的柄中顯著表達(dá)，因此，exg1可能在香菇子實(shí)體的菌柄伸長(zhǎng)中起到了一定作用。Sakamoto 等[42]純化并表征了另一種來(lái)自GH55 家族的香菇外切-β-1，3-葡聚糖酶，命名為exg2。實(shí)驗(yàn)表明，exg2在采后3 d 顯著上調(diào)，并具有很高的降解香菇多糖的能力。這些觀察結(jié)果表明，香菇中的exg2主要與收獲后的香菇多糖降解有關(guān)。與exg1基因一樣，exg2基因也在生長(zhǎng)過(guò)程中大量表達(dá)，這表明exg2可能在菌柄伸長(zhǎng)和子實(shí)體衰老方面具有雙重功能[42]。

（2）內(nèi)切-β-1，3 葡聚糖酶

目前已從香菇中克隆表征出兩種編碼內(nèi)切-β-1，3葡聚糖酶基因，即tlg1和glu1。Sakamoto 等[43]純化了一種與植物中高度保守的奇異果甜蛋白（thaumatin-like，TL）具有相似性的內(nèi)切-β-1，3-葡聚糖酶tlg1，并分離出與TL 蛋白具有高度相似性的編碼基因tlg1。tlg1表現(xiàn)出β-1，3-葡聚糖結(jié)合和β-1，3-內(nèi)切葡聚糖酶活性。試驗(yàn)表明，tlg1基因在香菇營(yíng)養(yǎng)菌絲體生長(zhǎng)的莖和新鮮子實(shí)體中的表達(dá)不顯著，然而，tlg1在采后在子實(shí)體中大量表達(dá)；同時(shí)，tlg1具有香菇多糖和細(xì)胞壁降解活性，這表明tlg1特異性參與了香菇多糖降解和子實(shí)體衰老。

隨后，Sakamoto 等[44]從采后香菇子實(shí)體中分離純化出另一種內(nèi)切-β-1，3 葡聚糖酶glu1。glu1作用于昆布多糖時(shí)顯示出比對(duì)香菇多糖更高的水解活性，證明其具有顯著的底物特異性。同時(shí)，glu1與已知的β-1，3-葡聚糖酶或任何糖苷水解酶沒(méi)有顯著的相似性。此外，氨基酸序列分析顯示，glu1與任何先前描述的功能蛋白沒(méi)有顯著的同源性，該酶和其他類似蛋白被分類在新的GH 家族GH128 中。與tlg1基因相似，glu1基因在香菇營(yíng)養(yǎng)菌絲體和新鮮子實(shí)體中的表達(dá)不顯著，但在采后子實(shí)體中大量表達(dá)，證明glu1也特異性參與了香菇多糖的降解和子實(shí)體的衰老。

（3）內(nèi)切-β-1，6 葡聚糖酶

Konno 等[45]從采后香菇子實(shí)體中純化了一種屬于GH30家族的內(nèi)切型β-1，6-葡聚糖氫化酶pus30a，其與灰擬鬼傘等擔(dān)子菌類物種中的β-1，6-葡聚糖酶蛋白質(zhì)具有高水平的相似性。試驗(yàn)表明，pus30a 基因在采后2～4 d 表達(dá)上調(diào)；pus30a 對(duì)香菇多糖無(wú)活性，但可以降解β-1，6-連接的低聚葡糖苷的細(xì)胞壁葡聚糖。這表明pus30a 在采后子實(shí)體衰老及特異性降解細(xì)胞壁多糖方面具有重要意義。

2.2.2 幾丁質(zhì)酶

真菌幾丁質(zhì)酶具有多重生理功能，包括降解外源幾丁質(zhì)、菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞壁重構(gòu)、菌絲子實(shí)體自溶等[46]。Sakamoto 等[47]在采后香菇中鑒定出3 個(gè)編碼幾丁質(zhì)降解酶的基因，即chi1、chi2和chi3，且3 個(gè)基因在采后表達(dá)顯著上調(diào)，表明幾丁質(zhì)酶的表達(dá)增加在收獲后的子實(shí)體衰老中具有重要作用。另外，已經(jīng)從采后子實(shí)體中克隆了編碼與幾丁質(zhì)修飾有關(guān)的推定酶的其他基因，包括幾丁質(zhì)脫乙酰酶（chd1）和殼聚糖酶（cho1）。據(jù)報(bào)道，采后香菇子實(shí)體中，chd1與cho1基因表達(dá)顯著上調(diào)。與此同時(shí)，chi1、chi2和cho1基因與其他擔(dān)子菌基因沒(méi)有顯著相似性，這表明與其他擔(dān)子菌相比，香菇具有獨(dú)特的幾丁質(zhì)和殼聚糖代謝系統(tǒng)[47]。

2.2.3 細(xì)胞壁降解酶之間的相互作用

綜上所述，包括外切-β-1，3-葡聚糖酶exg2 和內(nèi)切-β-1，3-葡聚糖酶tlg1 和glu1 在內(nèi)的細(xì)胞壁降解酶參與了收獲后的香菇多糖降解。為研究幾種細(xì)胞壁降解酶之間的相互作用，Sakamoto[6]通過(guò)使用pachyman 作為底物分析酶切得到的產(chǎn)物。結(jié)果表明（見(jiàn)圖1），內(nèi)切-β-1，3-葡聚糖酶tlg1和glu1會(huì)首先縮短香菇多糖的主鏈長(zhǎng)度，形成各種長(zhǎng)度的寡糖；然后exg2再將寡糖進(jìn)一步降解為葡萄糖和二糖；另外pus30a 會(huì)切斷部分降解的香菇多糖的側(cè)鏈[6]。因此，采后香菇子實(shí)體細(xì)胞壁降解是通過(guò)多種細(xì)胞壁降解酶的協(xié)同作用完成的。

圖1 細(xì)胞壁中香菇多糖降解機(jī)制Fig.1 Degradation mechanism of lentinan in cell wall

2.3 其他方面

活性氧代謝也是食用菌軟化的原因之一[7]。活性氧在果實(shí)采后貯藏期間不斷積累，可以與周圍分子發(fā)生反應(yīng)從而引起細(xì)胞損傷、破壞核酸結(jié)構(gòu)；同時(shí)，活性氧可以啟動(dòng)膜脂過(guò)氧化，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并最終促進(jìn)整個(gè)機(jī)體的衰老和死亡。目前，已有研究表明，活性氧代謝在龍眼[48]、香蕉[49]等園藝作物的軟化過(guò)程中起到直接的作用。然而，活性氧代謝與食用菌軟化之間的直接關(guān)系尚未完全明確。Poovaiah 等[50]認(rèn)為活性氧代謝對(duì)食用菌軟化起間接作用，他發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜的變化與軟化之間沒(méi)有關(guān)聯(lián)，但活性氧代謝誘導(dǎo)的細(xì)胞膜完整性的改變與子實(shí)體衰老直接存在顯著的相關(guān)性。Beelman[51]則認(rèn)為，活性氧代謝誘導(dǎo)的細(xì)胞膜完整性喪失可能引起膜通透性的增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膨脹壓力的降低，間接地降低食用菌質(zhì)地。

此外，微生物侵染對(duì)食用菌軟化也起著一定的作用。Nasiri[52]認(rèn)為微生物通過(guò)分解胞內(nèi)基質(zhì)和減小中央液泡的體積來(lái)改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞部分結(jié)構(gòu)塌陷引起軟化。而陳素芹[8]則認(rèn)為，微生物活動(dòng)僅可以起到加速食用菌自溶過(guò)程的作用，并不是導(dǎo)致雙孢蘑菇自溶軟化的直接起因。

3 食用菌軟化控制機(jī)理分析

食用菌的軟化被認(rèn)為是一個(gè)多因素調(diào)控的綜合過(guò)程，需要采取適當(dāng)?shù)牟珊蟊ｕr措施進(jìn)行抑制。目前，傳統(tǒng)的氣調(diào)包裝處理[18]和化學(xué)試劑浸泡處理[53]已經(jīng)廣泛用于食用菌采后品質(zhì)的研究。值得注意的是，超聲波處理[54]、涂膜包裝[55]、輻照處理[56]、電解水處理[57]等非熱加工技術(shù)也逐步應(yīng)用于食用菌采后生理生化的研究，這為食用菌采后品質(zhì)的保持提供了新的思路與方式。

本文從食用菌子實(shí)體細(xì)胞壁組分與結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁降解酶兩大方面對(duì)食用菌子實(shí)體軟化進(jìn)行了簡(jiǎn)要的闡述，這表明食用菌子實(shí)體采后軟化是一個(gè)多方面、多原因的綜合協(xié)同作用。然而，食用菌存在種類差異性和品種差異性，有的甚至還會(huì)存在栽培差異性，這導(dǎo)致食用菌種類之間、品種之間的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)存在一定的差異，無(wú)法簡(jiǎn)單地用幾種模型作物的細(xì)胞壁成分、結(jié)構(gòu)變化情況來(lái)反映所有食用菌的細(xì)胞壁降解結(jié)果及原因；另外，目前基因組測(cè)序技術(shù)的不完善，食用菌中只有少數(shù)菌種完成了測(cè)序，這意味著大多數(shù)食用菌只能從生理代謝角度來(lái)探究子實(shí)體軟化的原因，而無(wú)法進(jìn)一步通過(guò)分子技術(shù)來(lái)研究各菌種子實(shí)體軟化的原因。相信隨著食用菌“育種-種植-采收-貯運(yùn)”領(lǐng)域研究的不斷深入與分子技術(shù)的不斷發(fā)展，再輔以各種新的分析思路和分析方法，食用菌采后子實(shí)體軟化的原因一定會(huì)進(jìn)一步闡明。