受精液平衡方式對新建胚胎實驗室鼠胚實驗的影響

吳山強，李小冬，陳培芳，葉岳，吳建蘭，謝予揚

(廣西醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院生殖中心，梧州 543000)

近年來隨著我國不孕不育人群的不斷增多，越來越多的人需要接受輔助生殖技術(shù)(ART)助孕，獲取更多的優(yōu)質(zhì)胚胎是不孕不育人群成功妊娠的基礎(chǔ)[1]。保證卵母細胞受精質(zhì)量，優(yōu)化體外培養(yǎng)條件成為胚胎培養(yǎng)成功的重要因素，尤其是新建的人類ART胚胎實驗室，需要經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制才能將其運用于人類配子及胚胎的處理[2]。目前鼠胚實驗(mouse embryo assay，MEA)是最常用的ART胚胎實驗室質(zhì)量控制實驗，通過鼠胚實驗檢測實驗室的培養(yǎng)體系是否達到相應(yīng)的質(zhì)控要求[3]。我院生殖中心新建胚胎實驗室建成于2015年3月，經(jīng)過前期充分的通風和層流換氣、升溫并去除揮發(fā)性有機化合物(VOC)等[4]處理后，于2018年1～10月利用昆明小白鼠進行體外受精胚胎培養(yǎng)實驗，觀察當日配皿與前日配皿兩組實驗的受精率、卵裂率和2C囊胚形成率，對不同受精液平衡方式處理的小鼠卵母細胞體外受精及胚胎發(fā)育過程進行評價，從而為后期開展人類輔助生殖技術(shù)中卵子的體外受精及胚胎培養(yǎng)尋求最佳培養(yǎng)液平衡方案的選擇提供實驗基礎(chǔ)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

資料與方法

一、研究對象

SPF級昆明小白鼠購自于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，雌鼠4～10周齡，共204只；雄鼠6～12周齡，共100只。SPF級小鼠繁殖飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1～2周，晝夜光照為每日8∶00開燈，20∶00關(guān)燈，溫度18～26℃，相對濕度40%～70%。對同一批次雌鼠統(tǒng)一超促排卵后按照隨機原則分為當日配皿組與前日配皿組進行鼠胚實驗。

二、主要試劑及儀器

孕馬血清促性腺激素(PMSG)和絨毛膜促性腺激素(HCG)購自杭州第二激素制藥廠；培養(yǎng)體系選擇Quinn’s系列培養(yǎng)液(購自美國SAGE公司)；石蠟盤，滅菌動物解剖工具；Falcon培養(yǎng)皿、移液管、離心管、滅菌巴氏吸管等為美國BD公司Falcon系列；丹麥IVFtech工作站，蔡司體視顯微鏡，奧林巴斯倒置顯微鏡；日本Panasonic CO2培養(yǎng)箱和ASTEC三氣培養(yǎng)箱等。

三、研究方法

1. 當日配皿組中授精皿的制備：授精前1日16∶00在含9 ml Quinn’s 1020液的Falcon2001管中添加1 ml血清蛋白代用品(SPS)，10 ml移液管輕輕吹打5次混勻后松開蓋子置于37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜平衡。授精當日8∶00取出過夜平衡的含10%SPS的Quinn’s 1020液1 ml，在Falcon3037皿中小心添加1 ml后立即覆蓋0.8 ml培養(yǎng)油，放回37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱待當日授精用。

2.前日配皿組中授精皿的制備：授精前1日16∶00在含9 ml Quinn’s 1020液的Falcon2001管中添加1 ml SPS，10 ml移液管輕輕吹打5次混勻，在Falcon3037皿中小心添加1 ml含10%SPS的Quinn’s 1020液后立即覆蓋0.8 ml培養(yǎng)油，放回37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱待次日授精用。

3.卵裂期培養(yǎng)皿的制備：當日配皿組與前日配皿組均于授精前1日16∶30在Falcon3001皿中做30～50 μl含10%SPS的Quinn’s 1026液微滴，立即覆蓋2.5 ml培養(yǎng)油，放回37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱過夜平衡后待次日行卵裂期胚胎培養(yǎng)用。

4.囊胚期培養(yǎng)皿的制備：授精當天記為Day0(D0)，則D2 16∶00在Falcon3001皿中做30～50 μl含10%SPS的Quinn’s 1029液微滴，立即覆蓋2.5 ml培養(yǎng)油，放回37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱過夜平衡后待次日行囊胚培養(yǎng)用。

5.小鼠卵母細胞的獲取：選6～10周齡雌鼠進行超促排卵，于17∶30腹腔注射PMSG 10 U，48 h后腹腔注射HCG 10 U，次日早9∶30頸椎脫臼法處死，75%酒精消毒腹部后解剖取其輸卵管，用含10%SPS的HEPS-緩沖HTF操作液Quinn’s 1023將多余的血液和脂肪去掉，在體視顯微鏡下用1 ml無菌注射器劃破膨大壺腹部，滅菌的巴氏吸管將鼠卵于過夜平衡的含10%SPS的Quinn’s 1020中吹洗3次，隨機轉(zhuǎn)至當日配皿組與前日配皿組的Falcon3037授精皿中，置37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。

6.小鼠精子的獲取：選8～12周齡雄鼠用頸椎脫臼法處死，75%酒精消毒腹部后解剖取其附睪下段及輸精管中上段，用含10%SPS的HEPS-緩沖HTF操作液Quinn’s 1023將多余的血液和脂肪去掉，在含10%SPS的Quinn’s 1020液中用1 ml無菌注射器在體視顯微鏡下刺破附睪下端并擠出輸精管中精子，置37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱上游30 min～1 h，用40%與80%密度梯度液做非連續(xù)密度梯度離心，300g離心8～15 min，去上清；加入0.5～1.0 ml含10%SPS的Quinn’s 1020液，吹打混勻后300g離心5 min，去上清；留約0.2 ml沉淀物，再次加入0.5 ml含10%SPS的Quinn’s 1020液吹打混勻，置37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱，待授精用。

7.體外受精：卵母細胞在37℃、5%CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，將調(diào)好的精子用無菌巴氏吸管在遠離卵母細胞的地方按照1～3×106/ml的終濃度輕緩注入精子，完成當日配皿組與前日配皿組授精。放回37℃、5% CO2、5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h。取出Falcon3037授精皿，體視顯微鏡下將卵母細胞撈出，轉(zhuǎn)移至已過夜平衡的卵裂期培養(yǎng)皿，在倒置顯微鏡下觀察受精情況并記錄。

8.胚胎發(fā)育的觀察(圖1)：授精日記為D0、D1至D3早8∶00～9∶00觀察胚胎發(fā)育情況并記錄。D3觀察結(jié)束后將卵裂的胚胎轉(zhuǎn)至已過夜平衡的囊胚期培養(yǎng)皿，D5觀察囊胚情況并記錄。

A：劃破輸卵管壺腹部流出的小鼠卵泡團；B：受精卵；C：2細胞鼠胚；D：4細胞鼠胚；E：8細胞鼠胚；F：小鼠囊胚圖1 小鼠卵母細胞及胚胎發(fā)育過程(×10)

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、當日配皿組小鼠體外受精胚胎發(fā)育情況

當日配皿組共完成124個促排周期，總獲卵數(shù)為4 731枚，受精率為68.2%(3 227/4 731)，卵裂率為97.7%(3 152/3 227)，囊胚率為76.7%(2 419/3 152)，詳見表1。

二、前日配皿組小鼠體外受精胚胎發(fā)育情況

前日配皿組共完成80例促排周期，總獲卵數(shù)為2 683枚，受精率為84.5%(2 266/2 683)，卵裂率為99.6%(2 258/2 266)，囊胚率為88.8%(2 005/2 258)，見表2。

三、不同受精培養(yǎng)液平衡方式對小鼠體外受精及胚胎發(fā)育的影響

當日配皿組每促排周期獲卵數(shù)為(38.7±8.4)枚，前日配皿組每促排周期獲卵數(shù)為(35.1±6.4)枚，兩組間比較無顯著性差異(P>0.05)。當日配皿組的受精率、卵裂率和囊胚率分別為68.2%、97.7%和76.7%，均顯著低于前日配皿組的受精率、卵裂率和囊胚率(分別為84.5%、99.6%和88.8%)(P<0.01)，見表3。

表1 當日配皿組小鼠體外受精胚胎發(fā)育情況

表2 前日配皿組小鼠體外受精胚胎發(fā)育情況

表3 不同受精培養(yǎng)液平衡方式對小鼠體外受精及胚胎發(fā)育的比較[(-±s)，%]

討 論

培養(yǎng)液的平衡對卵母細胞、胚胎的體外培養(yǎng)產(chǎn)生很大的影響，其中尤其是PH與滲透壓的改變影響最為明顯[5]。PH受培養(yǎng)箱中CO2濃度的影響，當培養(yǎng)液從培養(yǎng)箱中取出后，大氣中CO2濃度的降低使得受精液中的PH緩沖系統(tǒng)發(fā)生改變[6-7]，而早期的胚胎發(fā)育對PH的波動尤為敏感，同時加上培養(yǎng)液滲透壓的不穩(wěn)定性等因素，更容易給胚胎發(fā)育帶來極為不利的影響[8-11]。

為了對新建的人類ART胚胎實驗室中人類卵母細胞受精液的配制及平衡方式進行前期試驗，本研究在配制含10%SPS的Quinn’s 1020培養(yǎng)液后按照先過夜平衡后配皿(當日配皿)與立即配皿再過夜平衡(前日配皿)分為兩組進行鼠胚實驗，觀察含10%SPS的Quinn’s 1020受精液不同的平衡方式對卵母細胞體外受精及胚胎發(fā)育的影響。研究結(jié)果顯示不同的受精液平衡方式對卵母細胞體外受精及胚胎發(fā)育具有明顯影響，當日配皿組的受精率、卵裂率和囊胚率分別為68.2%(3 227/4 731)、97.7%(3 152/3 227)和76.7%(2 419/3 152)均顯著低于前日配皿組的受精率、卵裂率和囊胚率[分別為84.5%(2 266/2 683)、99.6%(2 258/2 266)、88.8%(2 005/2 258)](P<0.01)。我們認為這可能與當日配皿組的受精液雖然在培養(yǎng)箱中平衡過夜，然而次日在配皿過程中，哪怕極短時間內(nèi)，在缺乏培養(yǎng)油的保護作用下，受精液中的CO2很快逸出，導(dǎo)致PH的波動以及滲透壓的改變。通過兩組實驗結(jié)果證明受精液的平衡過程應(yīng)該采取配液后立即配皿，利用培養(yǎng)油覆蓋受精微滴，然后再過夜平衡，這種受精液平衡方式更適合于卵母細胞的體外受精及后期的胚胎發(fā)育。因此建議在人類ART的應(yīng)用過程中，對受精皿的制備采用配皿過夜平衡16～18 h后再使用。有動物實驗證明過短的平衡時間會對卵母細胞的受精以及后期的胚胎發(fā)育帶來不利影響[11]。同時，培養(yǎng)油覆蓋受精液可以給胚胎更加穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，但無論何種情況下培養(yǎng)皿都不應(yīng)過久的在脫離培養(yǎng)箱環(huán)境下進行操作[12]，在撿卵、授精以及胚胎發(fā)育觀察過程中，應(yīng)盡快結(jié)束操作，減少PH、滲透壓以及溫度等的波動對卵母細胞及胚胎帶來的不利影響[13-15]。

綜上所述，胚胎實驗室內(nèi)受精液的平衡方式對昆明小白鼠卵母細胞的受精及胚胎發(fā)育可產(chǎn)生顯著影響。本研究明確了卵母細胞和胚胎培養(yǎng)皿的配制方式，同時也提示將來在人類胚胎實驗室中，應(yīng)該在配備溫度計等的基礎(chǔ)上增加PH與滲透壓檢測儀，并將胚胎培養(yǎng)液的PH與滲透壓納入實驗室的質(zhì)量控制中，探求不同培養(yǎng)液最佳的PH，這會給配子及胚胎提供一個更加安全、穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，以期給更多的不孕不育患者提供更加優(yōu)質(zhì)的胚胎，令患者在不斷發(fā)展的輔助生殖技術(shù)中受益。本研究驗證了當?shù)匦碌纳持行呐咛嶒炇业馁|(zhì)量控制，為桂東南地區(qū)人類ART技術(shù)的開展奠定了研究基礎(chǔ)。