IVM培養液中添加半胱胺、胱氨酸改善人卵母細胞胚胎發育潛能的研究

李青，趙海濱，張傳鑫，馬水英，李梅，吳克良

(山東大學附屬生殖醫院，濟南 250021)

人未成熟卵母細胞體外成熟(in-vitro maturation，IVM)技術是指從不孕患者體內獲得的未成熟卵母細胞，通過模擬體內卵母細胞的成熟環境，使卵母細胞恢復減數分裂，完成成熟并且具有受精和發育到胚胎階段潛能的技術。IVM技術雖然很早運用于臨床治療，但是體外培養的卵母細胞成熟水平和受精后的胚胎發育能力都低于體內成熟的卵母細胞[1]，如何獲得較好的發育潛能是IVM領域研究的熱點。卵母細胞成熟包括細胞核成熟和細胞質成熟兩個過程，只有二者都成熟的卵母細胞才能獲得較好的受精和胚胎發育能力。影響IVM的因素很多，主要包括體外培養時間、活性氧、O2濃度[2]、光照、溫度、pH和培養液成分[3-4]?；钚匝醯淖兓怯绊懧涯讣毎咛グl育的主要因素，適量的活性氧可以誘導卵母細胞成熟，但是過量的活性氧會引起氧化損傷。在哺乳動物卵母細胞內具有一定的抗氧化機制，可以清除卵母細胞內累積的活性氧，在卵母細胞成熟過程中，卵丘細胞、卵泡液和輸卵管液能夠保護卵母細胞免受氧化損傷。由于缺乏正常發育的條件，體外培養的卵母細胞存在細胞受損或停止發育的現象。

谷胱甘肽是一種重要的巰基還原物質，能夠保護細胞免受氧化損傷，卵母細胞胞質中還原型谷胱甘肽水平能有效反映卵母細胞的成熟質量[5]。有研究表明，卵母細胞IVM培養時，細胞核成熟快于細胞質成熟，并且IVM的卵母細胞內谷胱甘肽濃度低于體內成熟的卵母細胞[6]。卵母細胞內高還原型谷胱甘肽水平有助于卵母細胞核、細胞質發育的同步化。半胱胺是重要的抗氧化物質，能夠保護卵母細胞免受氧化損傷從而明顯提高受精后的胚胎發育潛能[7]。胱氨酸是谷胱甘肽的合成底物。大量動物實驗研究表明，在卵母細胞IVM過程中添加半胱胺或(和)胱氨酸能促進細胞內谷胱甘肽合成，進而提高胚胎的發育水平[8-9]。我們在前期山羊[10]和小鼠[11]研究中發現，IVM培養液中加入半胱胺和胱氨酸能夠明顯提高胚胎的發育潛能，且最佳濃度的半胱胺(100 μmol/L)和胱氨酸(200 μmol/L)使囊胚發育率最高。

在人卵母細胞IVM過程中，許多研究集中在向培養液中添加各種物質以提高卵母細胞的IVM和胚胎發育潛能，但結果表明未成熟卵母細胞經IVM、體外受精和胚胎培養后很少能發育至囊胚階段[12]。本研究首次在人卵母細胞IVM培養液中加入半胱胺和胱氨酸，觀察半胱胺和胱氨酸在未成熟卵母細胞體外培養中的作用，希望提高卵母細胞的成熟質量，以獲得較高的胚胎發育潛能，進而優化IVM培養體系，為不孕患者提供更多的妊娠機會。

資料與方法

一、研究對象

收集2017年1月至 2018年12月在山東大學附屬生殖醫院就診并行卵胞漿內單精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)患者的未成熟卵母細胞。納入標準：患者無吸煙、酗酒、吸毒等不良嗜好，年齡在20～38歲；取卵數大于6枚，且未成熟卵母細胞數/獲卵數的比例小于30%；不育因素為單純男方因素或同時合并女方輸卵管因素。排除艾滋病、梅毒、乙型肝炎抗陽性患者。女方經超促排卵HCG 36～38 h后在超聲引導下穿刺取卵。取卵后2～5 h 用透明質酸酶消化去除黏液團和顆粒細胞，將未成熟的 GV 期和 MⅠ期的卵母細胞用于本研究。ICSI注射所用精子來源于供精，由山東省精子庫提供。

本研究的開展獲得本醫院倫理委員會的批準，所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

1. IVM培養液的配制：IVM培養液需要提前一天配制，在TCM-199(sigma，美國)中加入10%人血清白蛋白(vitrolife，瑞典)、0.29 mmol/L丙酮酸鈉(sigma，美國)、50 U/ml青霉素、50 U/ml鏈霉素，置于37℃、6%CO2的培養箱中平衡過夜；第2天收集未成熟卵母細胞前4 h左右在培養液中依次加入10 ng/ml EGF(sigma，美國)、75 U/L FSH(serono，瑞士)、150 U/L HCG(serono，瑞士)。

半胱胺(sigma，美國)配制成20 mmol/L的儲存液，胱氨酸(sigma，美國)配制成50 mmol/L的儲存液，分裝后于-20℃冰箱保存，使用前用IVM培養液稀釋到所需濃度。

2. 未成熟卵母細胞的獲得：收集患者的卵母細胞，在37℃、6%CO2的培養箱中培養 2～5 h 后，用透明質酸酶消化掉卵母細胞周圍的黏液團和顆粒細胞，判斷卵母細胞成熟情況，成熟卵母細胞用于正常的ICSI治療。收集經確認后的未成熟卵母細胞，包括減數分裂Ⅰ(metaphase Ⅰ，MⅠ)期和有生發泡(germinal vesicle，GV)期的卵母細胞，將其隨機分為添加組和不添加組，添加組的卵母細胞培養時需在IVM培養液中添加100 μmol/L半胱胺和200 μmol/L胱氨酸；不添加組的卵母細胞培養時，單純使用IVM培養液。所有未成熟卵母細胞均過夜培養，24～28 h 后觀察卵母細胞成熟情況，以可見第一極體為卵母細胞成熟的標志。

3. 體外培養成熟后ICSI和胚胎培養：成熟卵母細胞用供精行ICSI，18～20 h后觀察卵母細胞受精情況，出現2個原核為正常受精(2PN)。卵裂率為正常受精卵分裂的比例。胚胎培養至第3天(D3)，卵裂球為7～10個細胞或者融合胚，碎片小于30%為D3優胚；胚胎發育至D5、D6進行囊胚評估[13]，評分為4BC及以上者為優質囊胚[14]。2PN分裂為優質胚胎的比例為優胚率。

三、統計學分析

采用SPSS 17.0軟件包對實驗數據進行，數據比較采用χ2檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、一般資料

共收集超促排卵周期中未成熟卵母細胞584枚，其中MⅠ期卵母細胞278枚，添加組141枚，不添加組137 枚；GV期卵母細胞306枚，添加組158枚，不添加組 148枚。

二、半胱胺和胱氨酸對GV期卵母細胞IVM及發育的影響

GV期卵母細胞IVM培養后，添加組卵母細胞成熟率為67.1%，不添加組卵母細胞成熟率為57.4%，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。添加組D3優胚率(46.7%)和優質囊胚形成率(26.7%)均顯著高于不添加組(分別為22.6%、9.7%)(P<0.05)；兩組的受精率和卵裂率比較差異均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

三、半胱胺和胱氨酸對MⅠ期卵母細胞IVM及發育的影響

MⅠ期卵母細胞經IVM培養后，添加組卵母細胞的D3優胚率(55.4% vs. 28.4%)和優質囊胚形成率(25.7% vs. 9.5%)均顯著高于不添加組(P<0.05)；但兩組的成熟率、受精率和卵裂率比較差異均無統計學意義(P>0.05)(表2)。

表1 半胱胺和胱氨酸對GV期卵母細胞IVM及發育的影響(%)

表2 半胱胺和胱氨酸對MⅠ期卵母細胞IVM及發育的影響(%)

討 論

隨著人類生育年齡的推遲和二胎政策的放開，女性生育要求日趨強烈，但是不孕癥、卵巢儲備功能不足、卵泡發育遲緩等女性生殖疾病的發生率也呈逐年上升趨勢，許多不孕不育患者選擇人類輔助生殖技術繁衍后代。IVM 技術不僅能充分利用常規IVF和ICSI技術中的未成熟卵母細胞、提高卵母細胞利用率，且能減少卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的發生，是治療多囊卵巢綜合征(PCOS)性不孕癥的有效方法[15]，為贈卵及女性生育力保存提供了更多選擇，具有很好的發展前景[16-17]。 IVM 作為新的助孕技術，目前在臨床和實驗室研究方面取得了一定的進展。IVM能夠充分利用IVF/ICSI中約15%的未成熟卵母細胞，提高了累積妊娠率和抱嬰率。對PCOS患者，IVM可以降低促排卵藥物的使用，避免 OHSS的發生。對于年輕尚未生育的腫瘤患者，IVM聯合IVF-ET能夠保存生育力，使其實現生育夢想。但IVM仍面臨成熟率、受精率、優質胚胎率及妊娠率低等問題[18]。

與體內成熟的卵母細胞相比，IVM的卵母細胞由于缺乏體內成熟的條件，核成熟和細胞質成熟不同步，從而影響卵母細胞的質量，所以目前IVM 培養液培養的卵母細胞，其胚胎種植率、臨床妊娠率、活產率均顯著低于成熟卵新鮮ICSI 周期。影響IVM的因素很多，常見的有：(1)培養時間：適當延長 IVM 時間可提高未成熟卵母細胞的細胞成熟率。(2)激素的添加：促性腺激素在卵泡發育中發揮重要作用，可刺激卵母細胞的成熟，有大量研究在IVM培養液中加入FSH[19]、LH、HCG或E2[20]等。(3)抗氧化劑的添加：IVM過程中卵母細胞容易發生氧化應激，從而導致體外成熟障礙，在卵母細胞IVM培養體系中添加某些抗氧化物質[21]可以提高培養效率。目前動物研究中常通過在IVM培養基中加入褪黑激素、谷氨酰胺、白藜蘆醇、肌醇、E-64、抗壞血酸和生育酚等以降低卵母細胞內活性氧水平[22-23]，從而降低氧化應激對卵母細胞的損害，但是在人卵母細胞IVM培養液中的相關研究則較少。

在本實驗中，我們在人卵母細胞IVM培養液中加入了100 μmol/L半胱胺和200 μmol/L胱氨酸，研究了半胱胺和胱氨酸對人未成熟卵母細胞IVM、受精和胚胎發育的影響。結果表明，無論對于GV期還是MI期卵母細胞，半胱胺和胱氨酸均能顯著提高D3優胚率和優質囊胚形成率，這與我們前期研究[10-11]得出的結論相符?？赡艿脑驗镮VM培養液中添加的半胱胺和胱氨酸提高了未成熟卵母細胞中的谷胱甘肽(GSH)水平，改善了卵母細胞的細胞質量，從而提高了胚胎的發育能力。

綜上，本研究的結果為進一步優化體外培養系統提供了重要線索，提高了常規IVF-ET周期未成熟卵母細胞的胚胎發育潛能，具有一定的臨床應用價值。但是對于半胱胺和胱氨酸提高胚胎發育潛能的機理仍有待于進一步的研究。