自然周期卵泡和子宮內膜發育及供精人工授精結局的影響因素

倪麗莉，侯振，王菁，刁飛揚，馬翔，張燕，劉嘉茵

(南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心，南京 210029)

正常育齡女性，自然周期卵巢規律排卵，子宮內膜在卵巢分泌的雌孕激素作用下發生同步增長及轉化，以接受胚胎著床。了解育齡女性自然周期卵泡和子宮內膜發育特點及其影響因素對診治不孕癥十分重要。現實工作中，對正常育齡婦女實施大規模調查和超聲監測存在較大困難，既往鮮有相關文獻報道。本研究選擇因男方因素行自然周期供精人工授精(AID) 助孕的婦女作為研究對象，通過分析這一人群的超聲監測數據及臨床資料，探討自然周期卵泡和子宮內膜的發育特點及其影響因素，以及后續AID宮內妊娠率的影響因素，為實施控制性促排卵(COH)治療及提高AID宮內妊娠率提供理論依據。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2012年1月至2018年12月在南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心接受AID助孕的1 200例婦女(共2 555個自然周期)的超聲監測及臨床資料。女方年齡20～40歲，平均(28.12±3.32)歲；體重指數(BMI)15.6～34.3 kg/m2，平均(21.62±2.84)kg/m2；整體宮內妊娠率為22.23%(568/2 555)。所有病例均符合原國家衛生部輔助生殖技術規范中的AID指征，并按規范要求實施AID助孕。

納入標準：女方排卵功能正常，并經輸卵管碘油造影或腹腔鏡手術證實至少排卵側輸卵管基本通暢。排除標準：(1)染色體異常；(2)排卵障礙；(3)3月之內有促排卵或中藥治療史；(4)排卵側輸卵管阻塞；(5)卵巢手術史；(6)醫源性卵巢功能下降；(7)單側卵巢；(8)影響卵泡發育的內分泌疾病(如高泌乳素血癥、甲狀腺功能減退或亢進、垂體或甲狀腺腫瘤)；(9)盆腔子宮內膜易位癥、宮腔粘連史、子宮或宮頸畸形患者。

按照不同因素(年齡、BMI、排卵時間、優勢卵泡個數、是否扳機)進行分組，比較各組卵泡和子宮內膜發育情況；按照宮內妊娠情況分為宮內妊娠組和宮內未妊娠組，比較兩組的女性年齡、BMI、優勢卵泡及子宮內膜發育情況等指標。

二、研究方法

1. 超聲監測：根據患者月經周期，在預測排卵日前3～5 d開始，采用陰道超聲診斷儀(陰道探頭頻率為5.0 MHz)連續監測卵泡發育和子宮內膜發育情況。

2. 授精時機：(1)排卵后AID：優勢卵泡直徑達16 mm后自發排卵者，排卵當日立即行AID。(2)排卵前AID：優勢卵泡達18～20 mm，內膜厚度達6 mm，給予肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)5 000～10 000 U，注射后約24 h行AID，48 h復查超聲明確是否排卵。未排卵者不列入本研究。

3. 精液來源和人工授精方法：所有精液來源于江蘇省人民醫院人類精子庫。使用前將凍儲精液取出，置入37℃電熱恒溫水浴箱復蘇10 min。精子解凍后均使用混勻離心法處理，其前向運動精子總數應≥10×106個。所有患者均行宮腔內人工授精(IUI)。

4. 黃體支持及隨訪：超聲確認排卵后口服地屈孕酮片(蘇威，荷蘭)10 mg或黃體酮膠丸(浙江愛生藥業)100 mg，2次/d，連續13 d。第14天檢測血β-HCG，陽性者20 d后行陰道超聲檢查，宮內發現孕囊者可確診為宮內妊娠，異位妊娠屬于宮內未妊娠。

5.觀察指標：女方年齡、BMI、排卵時間(排卵發生于月經周期的第幾天)、排卵前最大優勢卵泡直徑(以下簡稱優勢卵泡直徑)、排卵日子宮內膜厚度、AID后宮內妊娠率。

三、統計學處理

結 果

一、不同因素分組的患者卵泡和子宮內膜發育情況

1. 年齡：按年齡分為≤25歲、26～30歲、31～35歲、36～40歲4組。隨著年齡段的增長，排卵逐漸提早，排卵日子宮內膜逐漸變薄，差異均有統計學意義(P<0.05)；而優勢卵泡直徑差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 不同因素分組的患者卵泡及子宮內膜發育情況(-±s)

2. BMI：按BMI的中國標準分為偏瘦(BMI<18.5 kg/m2)、正常(BMI：18.5～23.9 kg/m2)、超重(BMI：24～27.9 kg/m2)及肥胖(BMI≥28 kg/m2)4組。隨著BMI的升高，排卵日子宮內膜逐漸增厚，前3組平均年齡逐漸增長，差異均有統計學意義(P<0.001)；而排卵時間和優勢卵泡直徑差異均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

3. 排卵時間：單樣本Kolmogorov-Smirnov擬合優度檢驗顯示排卵時間符合正態分布(Z=6.499，P=0.000)，第10、90百分位分別為13 d、21 d。按排卵早晚分為≤12 d、13～21 d、≥22 d三組。隨著排卵時間段推遲，平均年齡逐漸減小，排卵日子宮內膜逐漸增厚，差異均有統計學意義(P<0.05)；優勢卵泡直徑在數值上有縮小趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。

4. 優勢卵泡數目：按照優勢卵泡數目分為1枚組和2枚組。本研究中98.24%(2 510/2 555)的周期發育1枚優勢卵泡，1.76%(45/2 555)的周期發育2枚優勢卵泡(直徑大于14 mm)。發育2枚者最大優勢卵泡直徑顯著大于單枚者(P<0.05)；而平均年齡、排卵時間和內膜厚度組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

5. 是否扳機：按照是否扳機分為扳機組和未扳機組。未扳機(自發排卵)組優勢卵泡直徑顯著小于扳機組(P<0.001)；平均年齡、排卵時間及內膜厚度組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

二、卵泡及子宮內膜發育的相關因素

利用相關分析和偏相關分析(控制其他各種影響因素)了解優勢卵泡直徑及排卵日子宮內膜厚度與年齡、BMI、排卵時間、優勢卵泡數目之間的相關性。優勢卵泡直徑與排卵時間、優勢卵泡數目顯著相關(P<0.05)(表2)；排卵日子宮內膜厚度與年齡、BMI、排卵時間、最大優勢卵泡直徑顯著相關(P<0.05)(表3)。

表2 排卵前最大優勢卵泡直徑的相關因素分析

表3 排卵日子宮內膜厚度的相關因素分析

三、卵泡和子宮內膜發育參數的線性回歸分析

基于上述相關性，利用多元線性回歸分析建立各參數之間的線性方程。BMI=20.011+0.057×年齡(歲)(模型R2=0.005，F=11.557，P=0.001)，每增長1歲，BMI約增加0.057 kg/m2(P=0.001)。排卵時間=18.368-0.111×年齡(歲)+0.050×BMI(kg/m2)(模型R2=0.014，F=18.302，P=1.28E-8)，每增長1歲，排卵提早0.111 d(P=8.87E-9)；BMI每增加1 kg/m2，排卵推后0.05 d(P=0.028)。排卵前最大優勢卵泡直徑=19.064+0.443×優勢卵泡數目(個)-0.026×排卵時間(d)(模型R2=0.007，F=8.636，P=1.83E-4)；發育2枚優勢卵泡者，最大卵泡直徑較單枚優勢卵泡者增大0.443 mm(P=0.021)；排卵每推后1 d，優勢卵泡直徑縮小0.026 mm(P=0.001)。排卵日子宮內膜厚度=7.289-0.037×年齡(歲)+0.050×BMI(kg/m2)+0.098×排卵時間(d)+0.074×排卵前最大優勢卵泡直徑(mm)(模型R2=0.039，F=25.798，P=5.46E-21)，每增長1歲，排卵日子宮內膜厚度減少0.037 mm(P=0.002)；BMI每增加1 kg/m2，內膜增厚0.050 mm(P=2.41E-4)；排卵每延遲1 d，內膜增厚0.098 mm(P=2.02E-16)；優勢卵泡直徑每增加1 mm，內膜增厚0.074 mm(P=0.014)(圖1)。

四、AID宮內妊娠組與未妊娠組各項參數比較

統計結果顯示：與宮內未妊娠組比較，宮內妊娠組女方平均年齡顯著降低(P<0.05)，周期序號平均值顯著下降(P<0.05)，排卵日子宮內膜厚度顯著增加(P<0.05)。而BMI、排卵時間、優勢卵泡直徑及數目、排卵日子宮內膜三種分型(A型、B型、C型)比例、既往有妊娠史者占比、排卵側輸卵管通而欠暢者占比等組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)(表4)。

注：箭頭表示自變量與因變量之間存在顯著的線性相關；B：經多元線性回歸分析所得的偏回歸系數。圖1 影響卵泡和子宮內膜厚度各參數之間線性相關的模式圖

表4 AID宮內妊娠組與宮內未妊娠組各參數比較[(-±s)，%]

五、AID宮內妊娠的Logistic回歸分析

以表4內差異顯著的參數(年齡、周期序號、排卵日子宮內膜厚度)及臨床上可能影響AID結局的因素(BMI、優勢卵泡直徑、數目、排卵時間、輸卵管是否通而欠暢)為自變量，以AID助孕后宮內是否妊娠為因變量行Logistic回歸分析(逐步向前法)。結果顯示年齡、治療周期數、排卵日子宮內膜厚度與AID后宮內妊娠率顯著相關。每增長1歲，AID宮內妊娠率下降3.4%(OR=0.966，P=0.020)；每增加1個治療周期，周期宮內妊娠率下降10.9%(OR=0.891，P=0.037)；排卵日子宮內膜每增厚1 mm，宮內妊娠率升高5.8%(OR=1.058，P=0.019)；其余參數對AID宮內妊娠率無顯著影響(表5)。

結果顯示，排卵日子宮內膜厚度是AID宮內妊娠最有力的預測因子。將研究人群按內膜厚度分段(段距為1 mm)分組比較，當內膜厚度從<6.0 mm增至8.0～8.9 mm，AID宮內妊娠率從0直線升高至22.5%，8.0～14.9 mm的內膜厚度對應的AID宮內妊娠率在21.5%～25.0%之間波動，近似平臺期；內膜達15.0 mm后妊娠率繼續升高達28.6%；內膜達16.0 mm以上時宮內妊娠率出現第二個平臺期(33.3%)；由于內膜16.0 mm以上的周期數較少，故兩個平臺期的宮內妊娠率比較差異無統計學意義(P>0.05)(圖2)。

表5 AID周期宮內妊娠率的多因素Logistic回歸分析(逐步向前法)

圖2 AID宮內妊娠率與排卵日子宮內膜厚度的關系

討 論

卵泡和子宮內膜發育狀況是超聲可監測的影響受孕的關鍵因素。本研究發現排卵時間與年齡呈線性負相關，與BMI呈線性正相關。隨年齡增長女性體內抗苗勒管激素(AMH)水平下降，加速了竇卵泡募集和發育[1-2]，卵泡期縮短，且卵巢功能下降使黃體期募集優勢卵泡的概率增加[3]，故排卵日逐漸提前；卵泡期體內FSH濃度隨體重增加而下降，故BMI越高者FSH濃度越低，卵泡發育速度可能因此減慢，排卵越遲。自然周期發育兩枚優勢卵泡者，最大優勢卵泡直徑較單枚優勢卵泡者大0.443 mm。既往并無相關研究，推測原因可能是前者早卵泡期體內FSH濃度較高，促進優勢卵泡發育較大，但具體還有待于進一步研究證實。

子宮內膜充分增生并向分泌期轉化是胚胎著床的必要條件。在無法得到內膜病理的情況下，子宮內膜厚度是其增生程度的反映。本研究中排卵日子宮內膜厚度與年齡呈線性負相關。隨年齡增長，子宮內膜間質細胞中雌激素受體減少，內膜及內膜下血管化水平降低[4]、內膜血流量下降[5]，同時HOXA10等基因表達水平明顯下降[6]，進而影響子宮內膜增厚及其容受性。子宮內膜厚度與BMI呈線性正相關，這與既往文獻[7-9]結論一致。子宮內膜增厚、過度增生甚至癌變都與高雌激素作用有關[10]。因脂肪細胞可將雄激素轉化為雌激素，肥胖者被視為高雌激素狀態，故肥胖被公認為子宮內膜過度增殖甚至癌變的一大危險因素[11]。因此，為提高妊娠率并預防子宮內膜過度增殖，將女性BMI控制在正常范圍尤為重要。此外，內膜厚度與排卵時間、最大優勢卵泡直徑都呈線性正相關。說明子宮內膜不但隨著優勢卵泡增大、雌激素水平升高而增厚，同時也受雌激素作用時間——卵泡期長短的正面影響。

以往大量研究證實HCG日、取卵日及胚胎移植日的子宮內膜厚度都與IVF臨床妊娠率成正比[12-14]。本文利用Logistic回歸分析證實排卵日子宮內膜厚度是AID宮內妊娠最顯著的預測因子，這與既往的文獻[7-8，15]結論一致。本研究中，當排卵日子宮內膜厚度為9 mm以下時，宮內妊娠率隨排卵日子宮內膜增厚呈直線增長，說明這一范圍內尋找靶向治療方法增厚子宮內膜對提高AID宮內妊娠率最具臨床價值。內膜過厚是否會干擾胚胎著床而降低妊娠率，目前仍有爭議[16]。本研究中隨排卵日子宮內膜增厚，AID宮內妊娠率未出現明顯下降。由于內膜未達6 mm的患者僅2例，故暫無法得出內膜厚度6 mm以下者AID后不可能宮內受孕的結論。

隨年齡增長，卵泡內環境[17]、卵母細胞質量[18]、受精率、胚胎質量都逐漸下降，后續著床及宮內繼續發育的能力也隨之下降，故年齡本身是AID宮內妊娠率的獨立負面影響因子[19]。既往研究普遍認為女方年齡與IUI或AID臨床妊娠率顯著負相關[20-23]。僅有少量文獻的結論例外，但因為這些文獻的納入標準都為不明原因不孕患者，即使年輕患者也可能因潛在的不孕因素影響受孕，故而干擾了年齡對妊娠率的影響力[8，24]。另一方面年齡增長對排卵日子宮內膜厚度呈負面影響，間接降低了AID宮內妊娠率，這也是女性年齡與生育力呈負相關的另一重要原因。

治療周期數是AID宮內妊娠率的另一負面影響因子。這與既往多個研究結論一致。Dickey等[25]發現隨著治療周期數增加，IUI周期妊娠率逐漸下降；第5、6周期的妊娠率下降至2.8%，第6周期以后，再無成功受孕者。Esmailzadeh等[15]學者同樣利用多因素Logistic回歸分析證實治療周期數是IUI妊娠率最有力的預測因子。推測原因可能是某些患者因潛在的不孕因素(AID技術無法解決或改善)周期成功率較低，隨著治療周期數增加，該類患者所占比例逐漸升高，故周期成功率逐漸下降。

自然周期優勢卵泡大小及數目對AID宮內妊娠率均無顯著影響。由于最大卵泡直徑小于16 mm而自發排卵者已取消周期未納入統計，而卵泡直徑達20 mm時予及時扳機，故本研究中最大優勢卵泡直徑集中在16～22 mm。說明這一范圍內的優勢卵泡大小對AID宮內妊娠率并無顯著影響。自然周期優勢選擇作用和較大優勢卵泡排卵前LH峰常常影響第2枚優勢卵泡的發育。在發育2枚優勢卵泡的周期中，第2枚優勢卵泡直徑小于16 mm者占58%(26/45)。可能因此削弱了優勢卵泡數目對AID宮內妊娠率的正面影響。

本研究通過監測自然周期行AID助孕女性的卵泡和子宮內膜發育情況，利用分組比較、相關分析及多元線性回歸分析逐步證實年齡和BMI都顯著影響著自然周期卵泡和子宮內膜的發育。多因素Logistic回歸分析證實排卵日子宮內膜厚度、女方年齡、治療周期數是自然周期AID宮內妊娠率的顯著影響因子。為提高AID助孕效果，應將女方BMI控制在正常范圍，趁年輕盡早助孕，并積極尋找靶向治療方法優化子宮內膜。