氮素虧缺對蘋果愈傷組織硝態氮吸收及同化的影響

文濱濱，張新昊，沈紅艷，武紅玉，陳修德，肖 偉，高東升

（山東農業大學園藝科學與工程學院/山東果蔬優質高效生產協同創新中心/作物學國家重點實驗室，山東泰安 271018）

氮素是植物中重要的營養元素，其缺乏會導致葉片快速衰老[1-2]，而硝態氮是植物吸收的主要氮素形態，對植物的生長發育和物質代謝有不可替代的作用。NO3-在根系中被吸收以后，大部分通過蒸騰作用被轉運到葉片葉肉細胞中，在硝酸還原酶的作用下被還原為NO2-，并進一步在亞硝酸還原酶的作用下被還原為NH4+，之后進入葉綠體，在谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶的作用下NH4+被進一步同化為谷氨酰胺和谷氨酸[3-7]。當外界持續供氮不足時，易導致葉綠體的衰老降解，葉綠體衰老降解的同時，NO3-通過韌皮部轉運至生長旺盛的部位，但是氮的吸收和同化能力顯著減弱[8]。因此與氮同化和再活化相關的關鍵酶，包括硝酸還原酶 (NR)、亞硝酸還原酶 (NiR)、谷氨酰胺合成酶 (GS) 和谷氨酸合酶(GOGAT) 等活性受到衰老、脅迫等影響時將直接影響葉綠體的穩定性[9]。在這些酶中NR 是氮同化的主要限速酶[10]，GS 是氮同化和再活化的關鍵酶[11]。外界供氮水平將直接影響這些酶的活性[12]。在氮素虧缺條件下，過表達NR和NiR 基因可以提高植物對氮的吸收和同化，減少葉片中硝酸鹽含量，盡管這種轉錄調控作用不能促進植物的生長，但是氮素的利用效率卻顯著提高[13-14]。在煙草中沉默NR 基因的表達，植株NR 活性降低，NO3-在葉片中積累，影響了植株的生長發育[15]，所以植物體內自身氮素含量也可以調控植物的生長，NR 在調控過程中起主要作用[16]。

氮是果樹生長發育必需的礦質元素之一。但是過量施氮加劇了環境的壓力，造成土壤污染和水污染等[17-18]，當前的一些研究主要集中在氮素虧缺對蘋果實生幼苗及結果大苗生長發育的影響[19-20]，而氮素虧缺對植物干細胞愈傷組織生長發育及氮素同化吸收方面的研究較少，因此本試驗采用蘋果葉片的愈傷組織為試材，利用非損傷微測以及實時熒光定量PCR 技術在硝態氮虧缺和正常供氮的條件下，研究蘋果葉片愈傷組織中硝態氮的含量變化、硝態氮同化酶活性及相關基因表達的差異，旨在明確蘋果葉片愈傷組織中硝態氮吸收、同化的生理機制和分子基礎，豐富蘋果葉片吸收氮素的理論。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗材料為 ‘嘎拉3’(Malus x domestica ‘Gala 3’ )組培苗葉片傷口分化的愈傷組織。于2018 年5 月3 日在作物學國家重點實驗室、山東農業大學園藝科學與工程學院取繼代后一個月且長勢均勻一致的‘嘎拉3’組培苗，取完全展開的功能葉片，用滅菌的手術刀片沿垂直葉脈方向劃傷葉片并去掉葉尖和葉柄，葉背向上平鋪于MS 分化培養基中，每個平板10 片葉片，黑暗條件下預培養3 天，然后轉至光下培養7 天，葉片傷口處長出愈傷組織。將長出愈傷組織的葉片分別轉移至MS 蘋果分化培養基(CK，NO3-濃度 0.039 mol/L，總N 濃度 0.060 mol/L)，以及用NH4Cl、KCl 分別代替NH4NO3、KNO3的MS 硝態氮虧缺分化培養基 (T，NO3-濃度 0 mol/L，總N 濃度 0.021 mol/L)，培養3 周。人工氣候室的培養條件為14 h 光照 (24℃)、10 h 黑暗 (22℃)，相對濕度約為70%，光照強度為20000 lx。在轉板第0、1、3、7、14、21 天后分別取葉片傷口處的愈傷組織，測定硝態氮含量、NO3-流速、氮素同化酶活性和氮素同化酶基因相對表達量，每處理3 次重復。

1.2 分析項目與方法

1.2.1 葉片愈傷組織外觀和細胞形態的觀察 葉片愈傷組織的外觀形態使用Canon EOS 60d 相機拍攝。取轉板后的蘋果葉片愈傷組織，沿生長點方向縱切成0.5 cm3左右的小塊，FAA 固定液固定后用真空機抽真空，制作石蠟切片[21]。將愈傷組織切至8 μm 厚度的薄片，在Leica 光學顯微鏡下觀察愈傷組織的顯微結構并拍照。

1.2.2 硝態氮含量及硝態氮同化酶活性的測定 硝態氮含量的測定采用任同輝[22]的方法。硝態氮同化酶活性的測定使用試劑盒法，取蘋果葉片愈傷組織，稱取1 g，進行三次生物學重復，用液氮將標本研磨充分，加入9 g pH 7.2～7.4 的1 × PBS 緩沖液充分沖洗研缽。離心20 min(3000 r/min)，仔細收集上清。硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶試劑盒均采自上海通蔚 (貨號分別為ml48521j、ml69312j、ml15789j、ml25784j)，以空白孔調零，在450 nm 波長下用酶標儀 (iMARKTM Microplate Reader) 依序測量各孔的吸光度 (OD 值)。測定在加終止液15 分鐘以內進行。

1.2.3 愈傷組織NO3-流速的測定 采用山東農業大學農學院非損傷微測系統 (NMT100 Series, YoungerUSA LLC, Amherst, MA 01002, USA) 測定葉片和愈傷組織連接處的NO3-動態流速，選取葉片傷口處著生的愈傷組織，切除多余的葉片，保持切面平整光滑。將愈傷組織置于培養皿底部，用樹脂固定好，浸泡于含0.1 mmol/L KNO3、0.1 mmol/L CaCl2、pH 5.8 測試液中，平衡30 min。更換測試液，將傳感器尖端置于距離愈傷組織與葉片接觸點的切面約50 μm 處，開始檢測。每一個愈傷組織測試5 min，獲取NO3-流速數據[23-24]。每組 (不同時期) 進行6 個生物學重復。得到的NO3-流速值，正值代表外排，負值為內吸。

1.2.4 硝態氮同化酶基因的表達分析 分別取處理后第0、1、3、7、14、21 天的愈傷組織，置于液氮中速凍，放入-80℃冰箱備用。總RNA 的提取用TIANGEN(天根) 試劑盒，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，證實RNA 有18S 和28S 兩條明顯的完整條帶。使用反轉錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit withg DNA Eraser (Perfect Real Time，TaKaRa) 獲得cDNA，使用SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus) 試劑盒 (寶生物) 進行熒光定量PCR 反應。在NCBI 中找到基因的序列，使用DNAMAN 軟件設計熒光定量特異性引物 (表1)。最終采用Comparative CT(2-ΔΔCt) 法進行數據分析[25]。

1.3 數據處理

數據的整理與統計使用Excel 2003，用Spss20.0進行數據差異性分析，用Photoshop 和Graphpad Prism 6 作圖。

2 結果與分析

2.1 硝態氮虧缺對蘋果愈傷組織外觀形態的影響

硝態氮虧缺和正常供氮條件下的蘋果葉片愈傷組織如圖1 所示。結果表明，相對于對照組，轉到硝態氮虧缺的培養基中第7 天 (培養10 天后轉到新板7 天) 時，葉片切口處的愈傷組織和葉緣變黃，愈傷組織相對于對照組發育遲緩；轉板至14 天時，靠近培養基一側的葉片由葉緣向主葉脈變黃，愈傷組織發育停滯，靠近切口的愈傷組織出現黃化；轉板至21 天時，葉片嚴重失綠，愈傷組織黃化并失去分化能力，無法分化出幼苗。

表 1 RT-PCR 所用引物Table 1 Primers used for quantitative RT-PCR analysis

2.2 硝態氮虧缺對蘋果愈傷組織細胞形態的影響

細胞形態的規則性和完整性是硝態氮吸收同化的基礎，硝態氮虧缺處理對愈傷組織細胞形態的影響較大 (圖2)。轉板至3 天時，硝態氮虧缺處理的細胞體積變小、細胞間隙變大、排列疏松。轉板至7 天時，處理組細胞排列雜亂，細胞變長、間隙變小，無明顯細胞輪廓，此時與培養基接觸的愈傷組織由淺綠變為黃綠 (圖1)。轉板至14 天時，細胞變形，無細胞特征，細胞排列緊密，此時葉片萎蔫，愈傷組織黃化且體積無明顯變化。轉板至21 天時，硝態氮虧缺的愈傷組織細胞變化持續加重。

2.3 硝態氮虧缺對蘋果愈傷組織和葉片硝態氮含量的影響

圖3 結果表明，硝態氮虧缺處理后，蘋果葉片硝態氮含量在第14 天達到小高峰1.66 mg/g，在處理周期內無顯著差異。而正常供氮條件下，葉片中硝態氮含量呈逐漸降低的變化趨勢，且處理3 天后，處理組的蘋果葉片硝態氮含量顯著高于對照組。

硝態氮虧缺處理后，蘋果愈傷組織硝態氮含量呈先增加后降低的變化趨勢，第7 天達到峰值1.54 mg/g，相比于處理前，硝態氮含量增加了0.16 mg/g，與對照呈顯著性差異。最大降幅出現在7 天后，為13.64%，隨后呈相對穩定的變化趨勢，與葉片中硝態氮含量的變化相對應。

以上結果表明，在正常供氮條件下，葉片中的氮素含量逐漸降低，供應給生長旺盛的愈傷組織；而在硝態氮虧缺條件下處理7 天后，氮素由愈傷組織流向葉片。

2.4 硝態氮虧缺對蘋果葉片與愈傷組織連接處NO3-流速的影響

從圖4 可以看出，硝態氮虧缺處理中NO3-呈先內吸后外排再內吸的變化趨勢，轉板三天內，愈傷組織對NO3-一直處于吸收狀態，最大吸收速率出現在處理前，為22.38 pmol/(cm2·s)。處理1 天后下降幅度最大為84.1%，第3 天到第7 天是NO3-由吸收到外排的重要分界點，逆差為24.45 pmol/(cm2·s)。在處理第14 天時外排速率最大，為29.18 pmol/(cm2·s)，隨后NO3-由外排到內吸。對照處理NO3-呈現先內吸后外排再內吸再外排的變化趨勢，轉板一天后就出現外排現象，外排速率呈先升高后降低的變化趨勢，在第三天時外排速率最大，為94.52 pmol/(cm2·s)。以上結果表明，NO3-在葉片和愈傷組織之間呈動態平衡，持續供氮會造成NO3-的外排，短期適時缺氮可以提高愈傷組織對NO3-的吸收速率。

2.5 硝態氮虧缺對蘋果愈傷組織硝態氮同化酶活性的影響

NR 作為一種氧化還原酶，可催化硝酸根離子還原成亞硝酸根離子。NiR 是一類可以催化亞硝酸鹽還原的酶，可以將亞硝酸根離子還原為銨根離子。由圖5 可以看出，硝態氮虧缺處理后，NR 活性降低，處理至14 天時快速增加，增幅為19.26%。此時，與對照相比差異最大，為0.075 U/g，處理至21 天達到與處理前無顯著差異的水平。NiR 活性在處理后降低，處理至第7 天時出現小高峰，處理結束后上升幅度最大，為21.83%，此時差異最大，為0.08 U/g。

GS 和GOGAT 主要在葉綠體中發揮同化作用，GS/GOGAT 循環將葉肉細胞中的NH4+最終還原為氨基酸，所以GS 的變化勢必會引起GOGAT 的變化。硝態氮虧缺后，GS 和GOGAT 活性均呈先下降然后緩慢回升并保持穩定的變化趨勢，且在處理周期內GS/GOGAT 活性均顯著低于對照。缺氮處理1 天后，GS 活性最低，為0.22 U/g，與處理第3、7 天時無顯著性差異，處理7 天后稍有增加，增幅為22.9%。GOGAT 活性在第3 天時最低，為0.088 U/g。隨著處理時間的延長，酶活性增加并保持穩定。綜上，硝態氮虧缺后，硝態氮同化酶活性均降低，但在處理7 天后回升，說明此時是愈傷組織中氮素吸收同化的關鍵時期。

圖 1 硝態氮虧缺不同天數后葉片愈傷組織外觀形態Fig. 1 Effect of nitrate nitrogen deficient on the morphology of leaf callus at different days

2.6 硝態氮虧缺對蘋果愈傷組織氮素同化酶基因表達的影響

圖 2 硝態氮虧缺不同天數后愈傷組織解剖結構Fig. 2 Anatomical structure of leaf callus after different days with nitrate nitrogen deficiency

從圖6 可以看出，硝態氮虧缺處理后，氮素同化酶基因MdNR2、MdNIR、MdGS2、MdGOGAT 的相對表達量基本呈升高的變化趨勢。處理1 天后，MdNR 基因的表達量升高；處理至3 天時，增幅為373%，此時MdNR 基因的表達量高于對照；處理7 天后，MdNR2 基因表達量穩定并與處理14 天時無顯著差異。缺氮處理1 天后，MdNIR 基因的表達量開始緩慢增加；處理至7 天時，高于對照，并與處理14 天時無顯著性差異；處理結束后，MdNIR 基因的表達量為對照的2.52 倍。缺氮處理1 天后，MdGS2 基因的表達量高于對照，處理7 天后達到高峰，之后有所下降，處理結束后，MdGS2 基因的表達量為對照的11.37倍。MdGOGAT 基因的表達量在處理3 天內與對照無顯著性差異，隨后顯著上調，處理7 天時增幅為112%并與處理14 天時無顯著性差異；處理結束后，MdGOGAT 基因的表達量為對照的2.29 倍。以上結果表明硝態氮虧缺后，通過上調氮素同化酶基因的表達量來增強同化愈傷組織中的硝態氮，從而維持愈傷組織的正常生長。

圖 3 硝態氮虧缺對葉片和愈傷組織硝態氮含量的影響Fig. 3 The effects of nitrate-deficiency on nitrate contents in leaf and callus

圖 4 硝態氮虧缺對愈傷組織NO3-流速的影響Fig. 4 The effects of nitrate-deficiency on NO3-uptake flux in leaf callus

3 討論

3.1 硝態氮虧缺對蘋果愈傷組織生長及細胞形態的影響

前人研究表明，植物的細胞形態與生理功能密切相關，正常的細胞形態和器官構造是植物進行正常生命活動的基礎[26]。本研究在硝態氮虧缺處理7 天后，愈傷組織生長受到抑制，細胞形態發生改變，這與前人研究結果一致[27]。不過處理3 天內，愈傷組織細胞體積變小，細胞間隙變大，排列疏松，這種變化有利于細胞充分利用光能，增強蒸騰作用，并促進NO3-向愈傷組織中遷移[28]。所以短期缺氮處理，增強了NO3-的流動性，加速衰老器官中的NO3-向生長旺盛的組織中轉移，促進對NO3-的吸收，但是其分子機理還需要進一步探討。

3.2 硝態氮虧缺對蘋果愈傷組織NO3-吸收同化的影響

硝態氮是植物最容易吸收的氮素營養，其吸收和同化過程是植物正常生長發育的基礎[29]。NO3-的吸收不僅受植株體內氮豐缺狀況的調節還受到外界氮供應狀況的影響[30]。在本研究中，NO3-虧缺處理三天內，愈傷組織中NO3-吸收速率減小，但硝態氮含量增加。處理至第7 天時，NO3-由吸收變為外排，硝態氮含量達到峰值，隨后硝態氮含量呈下降的變化趨勢。初步認為愈傷組織中NO3-的營養狀況對NO3-的吸收/外排起到負反饋的調節作用，這與前人在大麥幼苗上的研究結果一致[31]，但是處理21 天后NO3-由外排轉變為吸收，硝態氮含量卻呈降低的變化趨勢，這可能與外界硝態氮虧缺有關，雖然愈傷組織吸收NO3-，但是NO3-的供應不足，導致愈傷組織中的硝態氮含量減少。NR 是NO3-同化的關鍵酶，其活性直接影響氮素代謝的效率，而介質中NO3-濃度直接影響NR 活性[32]。NO3-虧缺處理前期，愈傷組織中NR 活性降低，而在處理后期，NR 活性增加，NO3-可能轉化為其它形式的氮。NiR 和NR 活性的變化趨勢一致，但是NiR 活性的快速增加出現在處理后14 天，相比于NR 滯后一個時期，這與NO3-的同化過程相一致，NO3-在NR 的作用下被還原為NO2-，然后NO2-繼續被NiR 還原為NH4+。NO3-在葉肉細胞中被還原為NH4+后，進入葉綠體中完成同化過程被吸收利用，GS 在GS/GOGAT 氨同化過程中起關鍵性作用，是催化氨同化過程的第一步[33]。硝態氮虧缺處理后，GS 活性下降，在處理周期內無顯著性差異，而GOGAT 活性呈下降—升高—再下降的變化趨勢，且在第7 天出現峰值但是仍低于處理前活性，說明缺氮處理后GS/GOGAT 循環受到抑制作用，這與前人的研究結果不一致，即施氮處理GOGAT 活性顯著低于缺氮處理[34]，其主要原因可能與處理植物器官的不同有關，根系與葉片吸收同化氮素差異的機理還需進一步研究探討。

圖 5 硝態氮虧缺對愈傷組織氮素同化酶活性的影響Fig. 5 The effects of nitrate-deficiency on nitrogen assimilation enzyme activities in leaf callus

3.3 硝態氮虧缺對蘋果愈傷組織氮同化關鍵酶基因表達的影響

NR 是一種適應酶，對外界NO3-濃度的變化異常敏感。有研究表明在短時間缺氮條件下，NR 基因的表達量上升而較長時間時表達量大幅度下降[35]。本研究中氮素虧缺處理后，氮素同化酶基因MdNR2、MdNiR 呈先降低后上升的變化趨勢，并在處理21 天時達到峰值，而對照中MdNR2、MdNiR 基因的表達相對穩定，說明氮素含量調節基因的表達。MdNR2基因的表達量在處理3 天后出現大幅度上升，而MdNiR 基因大幅度上調表達出現在處理后14 天，存在表達量滯后現象，說明NR 和NiR 基因在愈傷組織中的表達存在一定的聯系。前人研究表明，增施氮素可以上調GS/GOGAT 基因的表達[36-37]，而在本研究中氮素虧缺處理后，GS/GOGAT 基因呈上調表達，在處理后21 天達到峰值。主要原因可能是隨處理時間的延長，愈傷組織中硝態氮和氨基酸含量不能維持愈傷組織的正常生長，通過刺激GS/GOGAT基因的上調表達來提高谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶的活性從而增加對NH4+的同化作用。在煙草的缺氮處理中發現，NO3-供應不足會導致NH4+合成量減少，而植物體內的蛋白質通過降解產生較多的NH4+，誘導GS/GOGAT 基因上調表達，從而加強對NH4+的同化作用[38]。在本研究中氮素虧缺處理三天內，氮素同化酶活性并沒有因酶基因的上調表達而增加，這可能是植物在氮素虧缺條件下基因的表達受到mRNA 加工、翻譯等的調控，但是具體的分子機制還需進一步研究。

圖 6 硝態氮虧缺對愈傷組織氮素同化酶基因表達量的影響Fig. 6 The effects of nitrate-deficiency on the expression of nitrogen assimilase genes in callus

4 結論

硝態氮虧缺處理3 天內細胞體積變小、細胞間隙變大，促進了愈傷組織對NO3-的吸收，增加硝態氮含量。處理7 天后愈傷組織細胞變形，NO3-由吸收變為外排，硝態氮含量降低，導致氮素代謝失衡，影響了愈傷組織的正常生長發育。