壺瓶碎米薺粗黃酮產品抗氧化研究

張春燕 唐巧玉 周毅峰，4

(生物資源保護與利用湖北省重點實驗室1，恩施 445000) (湖北民族學院林學園藝學院2，恩施 445000) (湖北省來鳳縣高級中學3，來鳳 445700) (湖北民族學院生物科學與技術4，恩施 445000)

機體的衰老和疾病大多數與體內的自由基有關，機體脂褐素的積累、組織細胞的破壞與衰減、免疫功能的降低、動脈粥氧化、腦血栓、腦損傷甚至癌癥的發生均與自由基的活動有密切關系[1-2]。人體中有一套清除自由基的特殊系統，但該系統的清除能力會隨著人年齡增長和體質下降而減弱，自由基的積累也逐步增加；在外界自由基大量侵入或因機體年老等原因導致自身自由基清除能力降低的情況下可補充抗氧化藥物進行輔助[3]。抗氧化藥物能與自由基進行結合反應，通過提供自由基所需電子來終止電子爭奪鏈式反應使其形成穩定狀態。

植物黃酮類物質是強力的天然抗氧化物質，獨特的生理結構使之具有較強的清除自由基能力，目前已被證實藤茶、銀杏、薄荷、首烏藤等的黃酮均有很強的抗氧化效果[4]。大量研究顯示，有機硒與無機硒均有較強的抗氧化活性，且有機硒的作用效果比無機硒更為顯著[5-6]。恩施所產的壺瓶碎米薺聚硒量平均在239～380 μg/g干重，其聚硒能力達到了目前所發現的聚硒植物的最高標準[7]，且已經有基因組研究表明，植物黃酮具有硒化的可能[8]。本研究以普通種植的壺瓶碎米薺與外源硒栽培的壺瓶碎米薺所提取的粗黃酮為材料，采用體外自由基清除法與小鼠體內抗氧化來考察抗氧化效果，以期為富硒壺瓶碎米薺的深度開發提供參考，為天然抗氧化藥物提供潛在資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 壺瓶碎米薺種植材料

一般種植壺瓶碎米薺：于湖北省重點實驗室溫室內進行水培，施以全霍格蘭德營養液，生長時間90 d。

外源硒種植壺瓶碎米薺：于湖北省重點實驗室溫室內進行水培，施以全霍格蘭德營養液，以亞硒酸鈉為外源硒肥，按硒質量濃度為45 mg/L加入水培箱中，每周1次，連續施加4周，生長時間90 d[9]。

1.1.2 實驗動物

8周齡昆明種小鼠102只，體重(20±2) g，實驗動物合格證號：XSD2017110011。

1.1.3 實驗試劑

蘆丁、無水乙醇、抗壞血酸、鄰苯三酚、無水醋酸鈉、磷酸二氫鉀、鄰二氮菲、冰乙酸、雙氧水、TPTZ、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷、硝酸鈉、硝酸鋁、七水合硫酸亞鐵、六水合氯化鐵均為分析純。SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、CAT試劑盒、MDA試劑盒。

1.1.4 實驗儀器

TU-1810紫外可見分光光度計；4510 原子吸收光譜儀；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計；AFS-930 d 原子熒光光譜儀；DFY-500搖擺式高速萬能粉碎機； TG16B臺式高速離心機；GZXGF-9053A智能型鼓風干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 制取壺瓶碎米薺粗黃酮產品

將采集的兩種材料分別在60 ℃恒溫烘干，粉碎，石油醚浸泡2 d進行脫脂處理，浸泡后濾掉石油醚并烘干，50 ℃低溫水提，離心清除蛋白質。清除蛋白質后高溫乙醇提取，將提取液合并減壓濃縮。濃縮液用四倍體積95%的乙醇溶解，濾掉沉淀物取上清液減壓濃縮，60 ℃恒溫烘干即得兩種材料粗黃酮產品(下文簡稱含硒粗黃酮與粗黃酮)。以蘆丁為標準品采用鋁鹽顯色法測兩種粗黃酮產品中黃酮含量，采用原子熒光法測兩種粗黃酮產品中硒含量[10]。

1.2.2 黃酮含量測定

配制質量濃度0.5 mg/mL的蘆丁標準溶液。取7試管，編號0～6，按照下表加入相應試劑用后55%乙醇定容至10 mL，搖勻后靜置10 min，用0號管作為對照測OD510值，測得標準曲線為y=0.005x-0.003，R2=0.999 2。黃酮標準曲線的制作見表1[11]。

表1 黃酮標準曲線的制作

注:*表示需搖勻、靜置6 min。

樣品含量按照公式計算：

樣品含量=C×V×N/m

式中：C為測得樣品溶液中的質量濃度/mg/mL；V為樣品溶液的最終稀釋體積/mL；N為稀釋倍數；m為材料質量/g[11]。

1.2.3 硒含量測定

將洗凈的消解管、25 mL以及100 mL容量瓶、10 mL離心管、小燒杯、玻璃棒等放入酸缸(里面為20%的HNO3)中浸泡過夜，取出清洗后，用超純水潤洗，放入烘箱中烘干備用[9]。

用移液槍吸取0.5 mL樣品，加入到消解管，做3個平行，同時設立一組樣品空白對照。各消解管中加入2 mL過氧化氫，微波消解儀180 ℃消解30 min。將消解管按順序取出后于每管加入12 mol/L的HCl 5 mL，再放入微波消解儀中用180 ℃消解1 h，將消解管中的液體轉入對應編號的10 mL容量瓶，超純水定容到 10 mL振蕩均勻。

通過氫化物發生-原子熒光光譜法測定已經處理好的樣品。配置標準系列、載流以及還原劑，標準系列配置見表2。回歸方程為：y=12.9x-50.8，R2=0.998 1。

表2 標準系列配置

1.2.4 兩種粗黃酮體外抗氧化實驗

羥自由基清除能力的測定：精確配制0.5 mg/mL粗黃酮、0.5 mg/mL含硒粗黃酮、0.5 mg/mL蘆丁以及0.5 mg/mL抗壞血酸。測定采用鄰二氮菲法進行測定[12]，每組做3個重復。搖勻后，37 ℃水浴60 min，用空白管做對照，在536 nm下測吸光度值。

超氧陰離子自由基清除能力測定[13]：用鄰苯三酚自氧化法進行測定，每組做3個重復，反應5 min后加濃鹽酸終止反應，在325 nm下測定各管的吸光值。

DPPH自由基清除能力測定[14]：分別配制0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mg/mL粗黃酮提取液、含硒粗黃酮提取液、蘆丁溶液、VC溶液以及0.1 mmol/L的DPPH溶液。調整樣品濃度，分別在不同濃度1mL樣品溶液中分別加入1 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，室溫避光反應30 min，517 nm測定吸光值。

清除率計算：清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%，其中A0為對照值，A1為測定值，A2為樣品在體系中的吸光值[14]。

總抗氧化能力測定：分別配制0.1 mg/mL含硒粗黃酮提取液、0.1 mg/mL蘆丁溶液、0.1 mg/mL VC溶液。在試管中先加入0.1 mL樣品，再加入2.4mLFRAP工作液，37 ℃條件下水浴20 min，于593 nm處測定吸光度[15]。

1.2.5 兩種粗黃酮小鼠體內抗氧化實驗

分組及處理：先將小鼠進行適應性喂養2周，后將102只小鼠分為17組飼養，分組為對照組L0，粗黃酮處理組A；含硒粗黃酮處理組B；陽性對照VC組C；陽性對照蘆丁組D。飼養過程中保證飼料與純水充足，先適應喂養2周后開始進行處理。每天固定時間灌胃1次，每次給藥1 mL。連續給藥4周，實驗期間正常飲食，注意觀測，4周后實驗結束。處理濃度見表3[6]。

表3 處理濃度

指標測定：小鼠連續連續給藥4周后禁食1 d，斷頭取血。血樣于4 ℃的冰箱中靜置后，在離心機中以4 000 r/min的轉速離心20 min，取上清液，分別按照SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、MDA試劑盒說明書方法測定血清中SOD活性、和GSH-Px活力與MDA含量[16-18]。

1.3 數據分析

所有實驗重復3次，采用SPSS 17.0、ORIGIN8.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 粗黃酮含量及硒含量

壺瓶碎米薺粗純物中黃酮含量及硒含量見表4。由表4可得，含硒壺瓶碎米薺粗純物黃酮含量為71.22%，一般種植材料粗純物的黃酮含量為73.84%，粗純物中黃酮含量較高，在一定程度上能反映出黃酮的特性；本實驗所提取的含硒粗黃酮中的硒含量為9.26 μg/g，顯著高于普通種植材料，說明硒元素能結合到黃酮中。

表4 粗純物中黃酮及硒的含量

注:同列字母不同表示具有顯著性差異(P<0.05),下同。

2.2 羥自由基的清除率

利用鄰二氮菲能與Fe2+形成絡合物，H2O2與Fe2+通過Fenton反應產生羥自由基可將Fe2+氧化為Fe3+，根據抗氧化物質還原Fe2+的多少，計算樣品的抗氧化能力的大小。

根據預實驗，確定測試粗黃酮的含量為0.5 mg/mL，配制同樣濃度的含硒粗黃酮、蘆丁標準品和抗壞血酸標準品作為對比，實驗發現，當加入0.2 mL樣液進行檢測時，兩種粗黃酮和蘆丁的清除率接近，能夠達到40%左右，而抗壞血酸的清除率趨近于零；當加入0.4 mL樣液時，兩種粗黃酮和蘆丁的清除率均高于60%；當加入0.6 mL樣液時，兩種粗黃酮和蘆丁的清除率趨近于80%，基本達到峰值，而VC的清除率仍然小于10%，實驗發現，當VC含量含量增加二十倍時，才能夠達到與之相同的效果，側面說明壺瓶碎米薺兩種粗黃酮的抗氧化活性約為VC的二十倍。實驗中兩種粗黃酮的IC50低于0.02 mg，遠低于其他植物中黃酮的含量，說明碎米薺含硒粗黃酮的抗氧化活性非常高。兩種粗黃酮的整體趨勢與蘆丁基本一致，顯著高于VC；含硒粗黃酮在高濃度時和普通粗黃酮達到顯著性差異(P<0.05)。羥自由基清除率如圖1所示。

圖1 羥自由基清除率注：字母不同表示同一濃度范圍內實驗組具有顯著性差異(P<0.05)，下同。

2.3 超氧陰離子清除率

本實驗采用鄰苯三酚自氧化法，在堿性條件下鄰苯淡粉能夠迅速自氧化，釋放出超氧陰離子自由基，生成中間物質，在420 nm下有強烈吸收峰。在加入鄰苯三酚后，一般在4 min的范圍內，氧化速率與時間呈線性關系，可計算鄰苯三酚的氧化速率。加入抗氧化劑后，鄰苯三酚的自氧化受到抑制，根據相對差值計算樣品清除率大小。實驗結果顯示，兩種粗黃酮對超氧陰離子有一定的抑制性，且隨著濃度的增加呈現正相關關系；在0.025 ～0.3 mg/mL范圍內，兩種粗黃酮和蘆丁對超氧陰離子自由基的清除率顯著低于VC，且在質量濃度為0.15 mg/mL時基本反應完全，蘆丁最大清除率為30%，壺瓶碎米薺普通粗黃酮最大清除率為35%，壺瓶碎米薺含硒粗黃酮最大清除率為40%。超氧陰離子自由基清除率如圖2所示。

圖2 超氧陰離子自由基清除率

2.4 DPPH自由基清除率測定

圖3 DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率如圖3所示。由圖3可得，兩種粗黃酮對DPPH自由基均具有良好的清除作用，兩組粗黃酮對DPPH自由基的清除效果基本一致，且在考察的質量濃度范圍內，清除率與質量濃度呈現正相關關系；在質量濃度0.04 ～0.24 mg/mL范圍內，兩種粗黃酮對DPPH的清除率隨著濃度的增加逐漸增加，清除效果顯著高于蘆丁而低于VC；在質量濃度為0.3 mg/mL時，兩種粗黃酮對DPPH的清除效果基本與VC持平。

2.5 總抗氧化能力測定

總抗氧化能力的檢測采用FRAP法，結果如圖4所示。在實驗考察的范圍內，兩種粗黃酮的抗氧化能力均顯著高于蘆丁(P<0.05)；在質量濃度0.025～0.15 mg/mL范圍內，普通粗黃酮與VC總抗氧化能力差異不顯著，且顯著低于含硒粗黃酮(P<0.05)；在高濃度時(質量濃度為0.25、0.3 mg/mL)兩種粗黃酮與VC總抗氧化力基本一致(P>0.05)。

圖4 總抗氧化能力

2.6 小鼠體重

由表5可得，處理4周后，壺瓶碎米薺粗黃酮(A組)4個實驗處理的體重均高于對照組，且A2與對照達到顯著性差異(P<0.05)；壺瓶碎米薺含硒粗黃酮(B組)4個實驗處理的體重均高于對照組，且B3組與對照達到顯著性差異(P<0.05)；陽性對照VC(C組)4個實驗處理的體重均高于對照組；陽性對照蘆丁(D組)低濃度處理組(D1、D2)體重高于對照組，高濃度處理組(D3、D4)體重低于對照組，且均未達到顯著性差異。

處理4周后實驗中A組、B組中小鼠體重均高于對照組，且在喂養過程中小鼠未出現致殘、致死等情況，說明壺瓶碎米薺粗黃酮與壺瓶碎米薺含硒粗黃酮對小鼠的生長未造成嚴重不良影響。

表5 小鼠體重/g

2.7 小鼠血液中抗氧化酶活性

過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)是細胞中清除自由基的主要抗氧化酶，而丙二醛(MDA)是細胞產生的氧化雜質，這幾種指標的測定結果能從側面反映出小鼠的抗氧化效果[19-20]，研究顯示，黃酮類物質主要通過調節抗氧化酶的活性從而達到抗氧化的效果[19]。

血清中抗氧化酶活性見表6。由表6得，通過4周的給藥處理后對比于正常對照組，實驗組(A、B)與陽性對照(C、D)均能提升小鼠血液中的SOD、GSH-Px與CAT活性，且所有實驗組中SOD、GSH-Px與對照組相比均達到顯著性差異(P<0.05)。

表6 血清中抗氧化酶活性/U/g

壺瓶碎米薺粗黃酮(A組)在25～75 mg/kg范圍內使小鼠血液中SOD、GSH-Px與CAT活性逐漸增加，且SOD值在各濃度間達到顯著性差異(P<0.05)；質量濃度75～100 mg/kg范圍內小鼠血液中SOD、CAT略微下降。

壺瓶碎米薺含硒粗黃酮(B組)在實驗組范圍內，隨著給藥濃度的增加均能使小鼠血液中SOD、GSH-Px與CAT活性均逐漸增加，且25 mg/kg與50 mg/kg的實驗組三種抗氧化酶的活性均達到顯著性差異(P<0.05)。

陽性對照VC(C組)處理組的三種抗氧化酶活性均最高，陽性對照蘆丁(D組)處理組3種抗氧化酶的活性的變化趨勢與A組類似。

壺瓶碎米薺粗黃酮(A組)處理效果顯著低于陽性對照VC(C組)，但與陽性對照蘆丁(D組)具有相似的效果，且A1D1、A2D2、A3D4、A4D5間均無顯著差異，說明壺瓶碎米薺的黃酮類物質主要成分可能為蘆丁。在含硒粗黃酮處理過程中三種抗氧化酶的活性效果呈現良好的遞增效應。含硒粗黃酮處理在質量濃度25～50 mg/kg時顯著低于C組(P<0.05)；但在75～100 mg/kg時與C組差異不顯著，說明壺瓶碎米薺含硒粗黃酮在一定濃度范圍內與VC具有相同的抗氧化效果。

2.8 小鼠血液中MDA值含量

血清中MDA含量見表7。由表7可得，通過4周的給藥處理后對比于正常對照組，實驗組(A、B)與陽性對照(C、D)均能降低小鼠血液中的MDA含量。壺瓶碎米薺粗黃酮(A組)在25～75 mg/kg范圍內使小鼠血液中MDA含量逐漸降低，除A1組外均與對照組達到顯著性差異。相同處理濃度條件下，MDA含量高于陽性對照組VC(C組)，且A2C2、A3C3、A4C4間均達到顯著性差異(P<0.05)；低于陽性對照與蘆丁(D組)，且同濃度組間均無顯著差異。

壺瓶碎米薺含硒粗黃酮(B組)在實驗組范圍內，隨著給藥濃度的增加均能使小鼠血液中MDA含量降低，且與對照組均達到顯著差異(P<0.05)。與陽性對照VC(C組)相比，B3組MDA含量低于C3組，B4組MDA含量低于C4組，且差異不顯著；與陽性對照蘆丁(D組)相比，相同濃度時均低于D組，且B1D1、B2D2、B3D3、B4D4間均達到顯著性差異(P<0.05)。

表7 血清中MDA含量

3 結論

壺瓶碎米薺含硒粗黃酮對體外自由基具有一定的清除作用，總體而言兩種粗黃酮的抗氧化效果與濃度呈正相關，且抗氧化效果高于蘆丁，除超氧陰離子外與VC效果基本一致。含硒粗黃酮的體外抗氧化效果略高于普通粗黃酮，但效果不顯著。動物實驗中，含硒粗黃酮效果顯著高于普通粗黃酮與蘆丁，說明硒進入小鼠體內后參與蛋白質及抗氧化酶的合成，故小鼠血液中抗氧化酶的活性增加，對小鼠體質、提高免疫力、自由基清除能力等各方面具有一定的增強效果，故含硒粗黃酮使小鼠的抗氧化效果顯著增加。