超臨界CO2夾帶乙醇萃取裂殖壺藻油脂的工藝研究

李佩雷 李紅娜 敬科舉 林潔茹 Andreea David 鄧 剛

(浙江師范大學化學與生命科學院1，金華 321004) (廈門大學化學化工學院2，廈門 361005)

裂殖壺藻(Schizochytriumsp.)是一種常見的微藻，其生長周期遠低于動物，因此通過發酵調控非常易于規模化培養[1]，發酵后的藻細胞中總油脂質量分數可高于70%[2]，其中ω-3長鏈多不飽和脂肪酸特別是二十二碳六烯酸(DHA)質量分數約為總油脂的30%～50%[3-4]，是一種理想的可替代深海魚油的DHA生產原料。隨著我國節能減排政策的推行及深化，相關環境友好的油脂綠色提取技術已成為研發熱點。其中，超臨界二氧化碳(scCO2)萃取工藝因其高壓、低溫、隔氧的操作環境，非常適用于提取易氧化、熱敏性的低極性脂類物質[5]，與傳統的有機溶劑提取工藝相比，不存在毒性成分殘留問題[6]，已在微生物油脂生產加工領域顯現出一定的優勢及應用前景[7-8]。

然而，裂殖壺藻細胞中，90%以上的油脂是以甘油三酯的形式存在[9]，其分子電荷排布均勻，屬于中極性脂，并含有少量的磷脂、糖脂等極性油脂[10]。顯然，對中性脂的提取而言，純超臨界CO2并不是理想的選擇，一些研究結合使用極性的助溶劑對其進行了改性。唐韶坤等[11]在裂殖壺藻原料中加入了等質量的95%乙醇，先進行了超聲波預處理，然后再用超臨界CO2進行萃取，油脂回收率由原來的29.2%提高到75.5%；Wang等[12]則用亞臨界狀態的CO2對乙醇進行膨脹(CO2摩爾比約為0.2)，用此類加壓流體從裂殖壺藻中提取了油脂，雖然最終油脂回收率可達87.0%，但整體工藝乙醇用量過大，減壓回收溶劑成本偏高。本研究擬采用超臨界二氧化碳夾帶乙醇流體從裂殖壺藻細胞中提取富含DHA的微生物油脂，有關這方面研究鮮見報道。根據二氧化碳-乙醇氣液相平衡性質確定了夾帶劑的加量范圍；對提取過程進行了動力學分析，設計響應面試驗優化了溫度、壓力、乙醇摩爾比等工藝條件；利用Peng-Robinson方程計算了混合流體密度，部分解釋了主要因素對油脂回收率的影響；最后通過氣相色譜測定了微藻油脂的脂肪酸組成及DHA含量，并與其他工藝進行對比分析，綜合評估了新工藝的特點及可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

裂殖壺藻(Schizochytriumsp.)：菌種由浙江師范大學菌種保藏中心保藏，經谷氨酸鈉固體培養基活化，30 ℃搖瓶培養2～3 d，轉接至5 L種子罐進行擴培，最后轉接至50 L機械罐進行發酵培養，接種量10%，培養溫度28 ℃，自動控制pH 6.5，通氣量為2 vvm，發酵時間約為4～5 d，發酵終止時殘糖濃度降至約5 g/L。發酵液在4 ℃，8 000 r/min的條件下，離心15 min，收集微藻細胞，經冷凍干燥后，研磨成粉。

1.2 儀器與試劑

FMG-5L和FUS-50L(A)機械發酵罐；HELIX超臨界天然產物萃取系統；K-501雙活塞往復泵；GC 7890A氣相色譜儀；BSA224S電子天平。

CO2氣體(純度≥99.9%)；甲苯、甲醇為色譜純；脂肪酸甲酯混合標準品、正己烷、乙醇等均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 微藻油脂提取方法

有機溶劑提取：稱取20.0 g微藻干粉，以正己烷為溶劑，采用索氏提取法，在80 ℃下抽提3 h。提取結束后，通過旋轉蒸發除去正己烷，稱重，試驗重復3次。一般而言，有機溶劑提取可視為微藻油脂的完全提取方法，為便于比較工藝，本研究定義了油脂回收率，即各工藝提取得到的油脂質量占有機溶劑提取得到的總油脂質量的百分比。

超臨界CO2夾帶乙醇提取：稱取20.0 g微藻干粉，與等體積玻璃珠混合，置于萃取釜，分別設置萃取釜和分離釜的溫度和壓力，由雙活塞往復泵精準控制夾帶劑乙醇的流速。提取過程中，每隔30 min取樣，稱重并計算油脂回收率。CO2流速保持在5 L/min，純超臨界CO2提取采用以上相同的裝置。

1.3.2 夾帶劑乙醇加入量的確定

圖1 CO2-乙醇氣液相平衡圖(323 K)

根據文獻查閱得到的熱力學數據[13，14]，繪制了323 K下CO2-乙醇氣液相平衡圖，如圖1所示。在此溫度下，超臨界CO2夾帶乙醇的操作壓力應大于臨界壓力(Pc，9.05 MPa)，而對應的二氧化碳摩爾比應大于其臨界摩爾比(xc，0.93 mol/mol)，由此可確定夾帶劑乙醇的摩爾比應控制在0～0.07的范圍內。以此類推，進一步查閱了313～333 K下的氣液相平衡數據，最終確定實驗中乙醇摩爾比參考范圍為0～0.09。

1.3.3 響應面優化試驗設計

對油脂提取過程進行動力學分析，由預試驗結果確定優化試驗所需的提取時間，采用Design Expert 8.0軟件，根據中心組合設計(CCD)進行響應面優化試驗，響應面優化試驗的因素及水平見表1。

表1 響應面優化試驗的因素及水平

1.3.4 微藻油脂肪酸組成及含量測定

甲酯化：采用Cavonius等[15]的方法，略加修改。稱取100 mg樣品，溶于2.5 mL甲苯，加入3 mL體積分數為10%的乙酰氯甲醇溶液，在氮氣保護下，80 ℃反應2 h。冷卻后，加入4.5 mL 6%碳酸鈉溶液。5 000 r/min離心5 min，取有機相，進行氣相色譜分析。

氣相色譜條件：毛細管分析柱為Agilent HP-5,30 m×0.32 mm×0.25 μm；載氣為高純氮氣(純度>99.99%)，流速為30 mL/min；進樣口、檢測器溫度分別為270、280 ℃，進樣量為1 μL，分流比100 ∶1。采用程序升溫：初始溫度為100 ℃，保持13 min，然后以10 ℃/min升溫至180 ℃，保持 6 min，再以1 ℃/min升溫至200 ℃，保持20 min，最后以4 ℃/min升溫至230 ℃，保持10.5 min。根據脂肪酸甲酯混合標準品確定樣品中的脂肪酸種類，采用面積歸一法計算脂肪酸相對含量，每個樣品重復測定3次[16]。

1.4 超臨界CO2夾帶乙醇流體密度估算

超臨界CO2夾帶乙醇流體的密度可用Peng-Robinson方程計算[17，18]。

(1)

(2)

式中：P為壓力/Pa；R為理想氣體常數/8.314 J/(mol·K)；T為溫度/K；Vm為摩爾體積/m3/mol；a為分子間引力，是關于溫度的函數；b為氣體總體積中包含分子本身體積的部分，是與臨界溫度和臨界壓力相關的常數。ρ為流體密度/kg/m3；xCO2、xEtOH分別為CO2、乙醇的摩爾比；MCO2、MEtOH分別為CO2、乙醇的相對分子質量/g/mol。

2 結果與討論

2.1 提取過程的動力學分析

在優化試驗前，根據預實驗結果，選取了溫度(40～60 ℃)、壓力(25～45 MPa)、乙醇摩爾比(0～0.09)的邊界值作為操作條件，分別繪制了超臨界CO2夾帶乙醇萃取裂殖壺藻油脂的提取過程曲線，如圖2所示。超臨界CO2夾帶乙醇流體提微藻油脂的動態過程大致分為以下3個階段[19]：1)恒定提取速率期(Constant-extraction rate period, CER)，油脂回收率以相對恒定的速率快速增加；2)減速提取期(Falling-extraction rate period, FER)，油脂提取速率減慢，但回收率仍在明顯增加；3)擴散控制提取期(Diffusion-controlled rate period, DCR)，油脂回收率以極緩慢的速率增加。盡管不同操作條件下，微藻油脂的提取速率各不相同，但提取3 h后均能進入擴散控制期，即可達到操作條件下最大油脂回收率。后續優化試驗的提取時間設定為3 h，事實上由于每批次提取試驗CO2的流速是恒定的(即乙醇摩爾比僅取決于乙醇泵入的流速)，因此也意味著每批次試驗的CO2用量恒定。

圖2 超臨界CO2夾帶乙醇萃取裂殖壺藻油脂的提取過程曲線

2.2 中心組合試驗結果及響應面模型

基于中心組合設計原理，進行了響應面試驗，并在各操作條件下計算了流體的密度，響應面中心組合實驗設計及結果見表2。對試驗值進行了多元線性回歸分析，擬合得到了二階多項式方程如下：

表2 響應面中心組合實驗設計及結果

表3 超臨界CO2夾帶乙醇萃取裂殖壺藻油脂的方差分析

2.3 操作壓力及溫度對微藻油脂提取的影響

溫度和壓力對裂殖壺藻油脂回收率的影響如圖3所示。在乙醇摩爾比為0.04的條件下，考察了溫度和壓力對超臨界CO2夾帶乙醇萃取裂殖壺藻油脂的影響。圖3a表明溫度為50 ℃時，隨著壓力增加，油脂回收率先增大后減小，當壓力約為38 MPa時，油脂回收率達到最大值85.5%。圖3b表明當壓力從25 MPa增大至38 MPa時，流體密度從846 kg/m3逐漸增大至935 kg/m3，溶劑化效應增強，有利于油脂溶解度的增加[20]，但壓力達到38 MPa后繼續增加，油脂回收率反而減少，原因可能是過高的壓力降低了物料的孔隙率，使流體難以擴散進入物料的孔狀結構內部，增加了傳質的阻力[21]。此外，在相同操作壓力35 MPa下，升高提取溫度也可以引起油脂回收率先增大后減小，如圖3a所示。溫度的升高一方面可以增大溶質的蒸氣壓，增加微藻油脂的溶解度；另一方面也會降低流體密度，使溶劑化效應減弱，阻礙油脂的提取[22]。兩方面效應存在競爭關系，在40～52 ℃范圍內，蒸氣壓效應占主導地位，油脂回收率從54.3%增大至最大值84.9%；在52～60 ℃范圍內，則受溶劑化效應控制，油脂回收率從最大值降至69.0%。

圖3 溫度和壓力對裂殖壺藻油脂回收率的影響

2.4 夾帶劑對微藻油脂得率的影響

乙醇摩爾比和壓力對裂殖壺藻油脂回收率的影響如圖4所示。夾帶劑在超臨界CO2流體萃取中作用機制尚存在很多爭議，最新基于統計熱力學理論的研究[23]認為夾帶劑與溶質之間的相互作用對溶解度的增加起主導作用，而其他效應如壓力變化引起的流體密度的增加、CO2及夾帶劑分子的簇集作用所引起的溶劑化效應，可忽略不計。圖5a和圖5b分別顯示了在超臨界CO2夾帶乙醇流體的操作區域內油脂回收率關于乙醇摩爾比、壓力的響應面圖及等高線圖。由圖可知，當壓力為35 MPa時，乙醇摩爾比由0增至0.04時，油脂回收率從71.6%增大到最大值84.3%，上升階段夾帶劑對油脂的增溶作用明顯；然而，當流體中乙醇的摩爾比繼續增大，則會導致流體總體極性過高，偏離了甘油三酯等中性油脂的極性范圍，油脂回收率反而降低，在乙醇摩爾比為0.09的條件下，油脂回收率僅為68.6%。

圖4 乙醇摩爾比和壓力對裂殖壺藻油脂回收率的影響

2.5 優化結果及驗證試驗

回歸模型的分析結果顯示，超臨界CO2夾帶乙醇流體提取微藻油脂的最佳條件為：溫度51.51 ℃、壓力37.64 MPa、乙醇摩爾比0.04，在此條件下，微藻油脂回收率的預測值為86.0%。考慮到實際操作的可行性，驗證試驗所采用的工藝條件為：溫度52 ℃、壓力38 MPa、乙醇摩爾比0.04，3組平行試驗的平均回收率為(88.2±0.5)%，與預測值基本相符，證明了在操作范圍內模型擬合程度良好。傳統的有機溶劑提取法可從20 g微藻中提取到4.98 g油脂，環境友好型的超臨界CO2夾帶乙醇流體萃取的油脂回收率接近90%，顯著高于相同溫度、壓力條件下純超臨界CO2提取的油脂回收率(71.9%)，表明了夾帶劑乙醇加入后，超臨界CO2流體對裂殖壺藻油脂具有明顯的增溶作用。

2.6 不同工藝條件下脂肪酸組成的對比分析

不同工藝條件下裂殖壺藻油脂的脂肪酸組成見表4，表中顯示了新工藝得到的微藻油脂的脂肪酸組成，并與純超臨界CO2流體及傳統有機溶劑提取工藝進行了對比研究。從脂肪酸組成分析結果來看，超臨界CO2夾帶乙醇流體提取得到的微藻油脂，完全可以達到傳統提取工藝的產品要求。作為DHA的生產原料，新工藝得到的裂殖壺藻油脂的DHA質量分數約為39.9%，高于純超臨界CO2流體及正己烷提取得到的油脂中的含量，這可能是因為夾帶劑乙醇的加入，一定程度上增大了流體的極性，從而更易提取得到DHA含量更高的極性磷脂[9]。超臨界CO2夾帶乙醇流體提取到的裂殖壺藻油脂中，總不飽和脂肪酸質量分數超過50%，相應的飽和脂肪酸比例略低于傳統工藝，屬于高品質的微生物油脂，主要可用于DHA的生產，以軟脂酸為主的副產物亦可用于其他油脂產品的生產。

表4 不同工藝條件下裂殖壺藻油脂的脂肪酸組成

3 結論

本研究采用超臨界CO2夾帶乙醇流體，從裂殖壺藻中提取油脂，通過中心組合設計試驗構建了響應面方程，經優化得到了最佳工藝條件：溫度52 ℃，壓力38 MPa，乙醇摩爾比0.04；在此條件下，微藻油脂回收率為88.2%，顯著高于純超臨界CO2萃取的回收率(71.9%)。結合構建的模型方程，以及通過Peng-Robinson方程計算得到的混合流體密度，部分解釋了溫度、壓力、乙醇摩爾比對油脂回收率的影響。夾帶劑乙醇的加入可將超臨界流體的極性范圍從低極性調整至中等極性，有利于富含DHA的中性微藻油脂的提取。氣相色譜對微藻油脂的化學組成分析結果表明，使用乙醇夾帶劑后，油脂中的DHA含量高于傳統工藝。由此可見，超臨界CO2夾帶乙醇流體萃取作為一種新型的、環境友好的綠色工藝，非常適用于富含多不飽和脂肪酸微藻油脂的提取，具有良好的應用前景。