響應面法優化超聲輔助離子液體提取黑豆異黃酮及其抗氧化活性研究

蘇 適 趙東江 王喜慶 遲彩霞 王 斌

(綏化學院食品與制藥工程學院，綏化 152061)

黑豆為豆科植物大豆的干燥種子，味甘性平，含有不飽和脂肪酸、蛋白質、異黃酮、多種微量元素等多種營養成分[1]，其中的異黃酮具有防治中老年骨質疏松癥、抗衰老、抗氧化、降低膽固醇等多種功效[2]。黑豆與普通大豆成分類似，但黑豆中的類黃酮化合物含量比普通大豆高5以上倍[3]。黑豆異黃酮還能有效抑制結腸癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤[4]，比黃豆有更高的醫藥價值和開發前景。

超聲提取法在中草藥的提取中應用較多，利用超聲波的空化效應和機械效應，破壞植物組織細胞[5]，將植物中的化學成分快速提取，具有操作簡單方便，提取液雜質少等特點。離子液體(ionic liquid)在室溫下完全由離子組成的液體物質[6]。離子液體可用于超聲輔助提取天然產物，具有理化性質穩定、萃取能力好、可重復利用等特殊性質。陳明明等[7]采用離子液體輔助超聲提取黃柏中的總生物堿，優化了提取工藝，與傳統工藝相比，具有環境污染小，溶劑可重復使用，提取率達到 5.35%。張喜峰等[8]采用離子液體超聲輔助提取桑葚中的原花青素，掃描電鏡觀察，此方法對桑葚粉末微觀結構破壞影響較大，在此條件下獲得桑葚中原花青素得率為3.51%，而超聲輔助提取得率僅為 2.46%。鐘方麗[9]等研究了采用離子液體超聲輔助提取香葉中總黃酮，與傳統超聲輔助醇提工藝相比，總黃酮提取率提高了45.46%。采用離子液體-超聲輔助提取黑豆中異黃酮的研究鮮見報道，因此，本實驗采用此方法研究黑豆異黃酮的提取工藝，同時，研究異黃酮的抗氧化活性，為深入研究其生物活性及保健藥物的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青仁黑豆，產地：黑龍江省。

金雀異黃酮標準品(純度 98%)；1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽(純度 98%)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)；抗壞血酸；無水乙醇；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KQ-50B超聲波清洗器；101C-2B電熱鼓風干燥箱；XV-9200紫外分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線

準確稱取金雀異黃酮標準品1.0 mg，用95%的乙醇溶液配制成濃度為 1 mg/mL的標準溶液，分別移取 0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL 的標準溶液，置于10 mL的容量瓶定容，在 260 nm 處測定吸光度。以金雀異黃酮的濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程y=0.112 6x，R2=0.997 9。

1.3.2 黑豆異黃酮的提取

黑豆粉碎→過60目篩→按照料液比1 ∶3 加入正己烷，脫脂 2 次→離子液體-超聲提取→提取液離心→測定異黃酮含量。

1.3.3 提取率計算

量取2.0 g已脫脂黑豆粉，加入一定濃度的離子液體，在一定條件下采用超聲波輔助提取黑豆異黃酮，以5 000 r/min 離心30 min，得到濾液，按1.3.1項下方法測定其吸光度，并根據回歸方程，計算黑豆異黃酮濃度及提取率。

式中：C為測得質量濃度/μg/mL；V為定容體積/mL；n為稀釋倍數；M為原料質量/g。

1.4 提取工藝優化

準確稱取已脫脂的黑豆粉末2.0 g，采用離子液體-超聲輔助法提取黑豆異黃酮，考察離子液體濃度(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L)、提取溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)、料液比(1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35)、超聲時間(10、20、30、40、50、60 min)對黑豆異黃酮提取率的影響。

1.5 響應面實驗設計

根據單因素實驗，選取離子液體濃度(A)、提取時間(B)、液料比(C)、提取溫度(D)，黑豆異黃酮收率為響應值，根據Box-Behnken Design中心組合設計原理，優化黑豆異黃酮提取工藝，以異黃酮的提取率為響應值，建立響應回歸模型，因素水平見表1。

表1 響應面試驗設計

1.6 黑豆異黃酮抗氧化活性測定

1.6.1 黑豆異黃酮對羥自由基清除能力的測定

黑豆異黃酮及VC對羥基自由基的清除率，采用水楊酸法進行測定。對黑豆異黃酮羥自由基的清除能力進行測定，VC做陽性對照，A0為空白對照液的吸光值；A1為分別加黑豆異黃酮及 VC 后的吸光值；A2為不加 H2O2時的吸光值，計算清除率。

1.6.2 黑豆異黃酮對DPPH·清除能力的測定

測定黑豆異黃酮對DPPH·自由基清除率。DPPH·清除率與抗氧化能力呈正相關。分別量取 0.05，0.10、 0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL的黑豆異黃酮提取液和 0.1 mol/mL DPPH·溶液各2 mL，混合置于10 mL 比色管中，60% 乙醇定容至刻度，在室溫條件下暗處放置30 min，測其吸光度值為 260 nm作為Am；用乙醇溶液分別代替DPPH·和黑豆異黃酮提取液，同法測定其吸光度分別為An和Ak，計算清除率。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 提取時間對提取率的影響

由圖1可知，隨提取時間的不斷增長，異黃酮提取率呈現增長趨勢，提取時間為40 min時，提取率達到最大值，但時間超過40 min，提取率開始降低。隨著超聲時間延長，通過超聲波空化作用和機械震動的持續作用，提取成分逐漸溶出，提取率逐漸升高；提取時間過長導致黑豆細胞組織中大量細胞破裂，同增加其他雜質的溶出。因此，超聲時間選擇40 min。

2.1.2 離子液體濃度對提取率的影響

由圖1可知，隨離子液體[Bmim]Br 濃度的增加，異黃酮的提取率逐漸增加，當[Bmim]Br 濃度為 0.8 mol/L 時，異黃酮提取率達到最大值，但隨著離子液體濃度超過 0.8 mol/L，提取率略有下降。原因可能是與提取溶劑的黏度相關，離子液體的濃度過高，提取液黏度也會繼續增大，溶液擴散能力變差，更難滲到黑豆細胞的內部，使得[Bmim]Br對黑豆異黃酮的溶出能力降低。因此，選擇離子液體[Bmim]Br 濃度為 0.8 mol/L。

2.1.3 料液比對提取率的影響

由圖1可知，隨著料液比的增長，異黃酮提取率逐漸增大，料液比為1 ∶25(g/mL)時，達到最大值，但料液比超過1 ∶25(g/mL)，提取率開始下降。隨著料液比的增大，黑豆粉末在溶液中的分散程度增大，與提取劑的接觸面積增大，有利于溶出；但大量溶劑會吸收一定的超聲波，降低了超聲波對細胞的破碎能力，導致細胞內異黃酮溶出減少。因此，料液比選擇1 ∶25(g/mL)。

2.1.4 提取溫度對提取率的影響

由圖1可知，隨著溫度升高，異黃酮提取率逐漸增大，當溫度為50 ℃時，提取率最大，繼續升溫，提取率下降。可能是隨著溫度升高，離子液體的運動速率和頻率增大，更易滲透到黑豆組織細胞，加速異黃酮的溶出。但繼續升溫，使異黃酮結構上的酚羥基發生氧化；隨著溫度升高，細胞中其他內容物溶出增多，溶液黏度增大，影響異黃酮溶出，提取率下降。所以，選擇提取溫度50 ℃。

圖1 提取時間、離子液體濃度、液料比和提取溫度對異黃酮提取率的影響

2.2 響應面結果分析

2.2.1 響應面設計及結果

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據分析，得到二次回歸擬合方程Y=+0.42+7.833×10-3A+3.750×10-3B+7.917×10-3C-1.500×10-3D-7.50×10-3AB+2.500×10-4AC-2.500×10-3AD-3.000×10-3BC+3.000×10-3BD-1.500×10-3CD-0.036A2-0.016B2-0.011C2-0.020D2

表2 響應面實驗設計方案

表3 方差分析表

注:P>0.05為不顯著；P<0.05為顯著；P<0.01為極顯著。

2.2.2 響應面分析

響應曲面圖可以顯著反映各因素之間相互作用的強弱，采用Box-Behnken 軟件進行分析。響應曲面越陡峭，則表明該因素對異黃酮得率的影響越大，響應值對于操作條件的改變越敏感；反之，曲面越平緩則影響越小；等高線越接近于橢圓形兩因素交互影響越大，越接近于圓形交互影響越小。離子液體濃度與提取時間、料液比、提取溫度之間交互作用對提取率的影響極顯著，曲線較陡；響應曲線平緩可知，提取時間與料液比、提取時間與提取溫度、料液比與提取溫度的交互作用對提取率的影響不顯著，表現為曲線較為平滑，響應值無顯著性變化。

2.2.3 驗證實驗

結合單因素實驗，分析回歸模型，經過驗證，最終得出該提取方法準確可靠。黑豆異黃酮的最佳提取條件：離子液體濃度0.76 mol/L，提取時間41.56 min，料液比1 ∶23.70，提取溫度48.94 ℃，理論預計值0.422%。結合實驗實際情況，最終選擇離子液體濃度0.75 mol/L，提取時間40 min，料液比1 ∶23，提取溫度50 ℃，進行5次平行實驗，得到異黃酮提取率平均值為0.419%，與預測值接近，驗證了此模型的有效性，說明預測模型與實際情況擬合較好。

2.3 黑豆異黃酮的抗氧化活性分析

2.3.1 對DPPH·自由基清除率測定

由圖2可知，在一定范圍內，隨著濃度的增加黑豆異黃酮和VC對羥基自由基清除率均逐漸增強，說明二者對羥基自由基的清除能力均存在著一定的量效關系。結果表明，黑豆異黃酮對DPPH·有很大的清除力。

圖2 對DPPH·的清除作用

2.3.2 黑豆異黃酮對·OH的清除能力

VC和大豆異黃酮對·OH的清除能力，結果見圖3。由圖3可見，黑豆異黃酮對·OH有一定的清除能力，且隨著異黃酮質量濃度的增大，其清除能力也不斷增強。異黃酮在實驗的質量濃度范圍內對·OH的清除能力要高于VC。

圖3 對·OH清除作用

3 離子液體的回收

由于[Bmim]Br離子液體的密度大，沸點高，提取后的離子液體中加入與其不互溶的乙酸乙酯來分離異黃酮、分離出與乙酸乙酯不互溶的離子液體，再減壓蒸餾蒸除水分，再在真空烘干箱中65 ℃烘干，將分離出的離子液體進吸光度測定，回收的離子液體吸光度值與未使用過的離子液體吸光度值接近。采用回收的[Bmim]Br離子液體進行重復提取，進行 3 次平行試驗，提取率達到首次提取率的92.55%，因此，溶劑可再重復利用。

4 結論

本研究采用離子液體-超聲輔助提取法，對黑豆異黃酮的提取工藝進行了研究。根據響應面法優化提取工藝，得到最佳工藝條件為：離子液體濃度為0.75 mol/L、料液比 1 ∶23(g/mL)、提取溫度50 ℃、超聲時間 40 min，進行5次平行試驗；在此條件下黑豆異黃酮的提取率可達0.419%。離子液體的極性可控，可以對中藥中的復雜成分進行選擇性提取，與傳統提取工藝相比，該提取工藝時間短，所需溶劑少，離子液體可重復利用。

黑豆異黃酮抗氧化性能結果表明，異黃酮具有較強的抗氧化活性，在一定質量濃度范圍內，隨樣品質量濃度的增加，其抗氧化性能也不斷提高；其清除羥自由基的能力高于VC，當質量濃度高于100 mg/mL時，對DPPH·清除率高于VC。本實驗采用離子液體超聲輔助提取黑豆中異黃酮，獲得較優提取工藝參數，可為黑豆深層次開發提供參考，是一種快速高效提取黑豆異黃酮的理想方法。