人熱休克蛋白B6在膀胱癌組織中的表達及其預后意義

周皓潔，邵凱迪，沈雪敬，陸士新，王留興

(鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科，河南 鄭州 450052)

中國國家腫瘤注冊中心2015年報告顯示，在男性惡性腫瘤的發病率中，膀胱癌和前列腺癌分別居第6、7位；在過去幾年中，膀胱癌的發病率和死亡率逐漸增加[1]。膀胱癌不僅發病率高，且復發率高，臨床上需要患者定期行經尿道膀胱鏡復查，增加了患者的經濟負擔[2]。然而目前并無對膀胱癌特異性較強的標志物。因此，本文旨在探索能夠較好診斷及評估病情的膀胱癌相關標志物。

人熱休克蛋白B6( heat shock protein B6,HSPB6)也稱為P20，在心肌及其他許多人體組織中高表達。HSPB6在生理條件下無活性或具有部分活性，在應激激酶調節后轉變為活性磷酸化狀態[3]。磷酸化的HSPB6抑制轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-α誘導的肝癌細胞遷移和侵襲，且HSPB6過表達可誘導結直腸癌細胞凋亡而顯著抑制細胞進程[4]。然而，HSPB6是否與膀胱癌的發生、發展、患者預后相關，目前尚無研究證實。

1 資料與方法

1.1 TCGA數據庫癌癥基因組數據庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA)是一個公共資助的項目，旨在編目和發現主要的致癌基因的突變以創建癌癥基因組譜的全面“圖譜”。到目前為止，TCGA共覆蓋人體60多個組織或器官的癌種及其亞型、50多個項目、3 000多例患者，綜合分析了2 000多種基因。本文通過分析TCGA數據庫中的數據揭示HSPB6與膀胱癌臨床病理特征和預后的相關性.

1.2 應用Oncomine數據庫分析HSPB6的表達Oncomine(https://www.oncomine.org/resource/login.html)是一個基于癌癥基因芯片數據和互聯網數據的挖掘平臺，旨在促進全基因組表達的新發現，并將常見癌種的癌組織與對應的正常組織轉錄組數據進行比對[5-6]。迄今為止,該數據庫已經收集了715個基因表達數據集, 86 733個癌組織和正常組織的樣本數據。我們在Oncomine數據庫收集的413項不同類型的研究中分析了HSPB6的表達差異，并對HSPB6與膀胱癌關系研究的其中4項研究的數據進行了Meta分析。

1.3 應用GEPIA數據庫分析HSPB6與膀胱癌患者的生存預后基因表達譜數據動態分析(gene expression profiling interactive analysis，GEPIA；http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)是由北京大學開發的交互式Web服務器，提供包括差異表達分析、分析繪圖、相關性分析、患者生存分析、相似基因檢測等功能[7]。本文通過GEPIA分析HSPB6與膀胱癌的生存預后的關系。

1.4 應用HPA進一步印證HSPB6在膀胱癌與正常膀胱組織表達差異人蛋白質數據庫(The Human Protein Atlas，HPA；https://www.proteinatlas.org/)是一個收集44種正常人體組織和20種癌組織中分布的20 356種蛋白質的公共數據庫。本文通過HPA搜集了膀胱癌及正常膀胱組織的免疫組化染色圖，印證我們關于HSPB6表達差異的猜想。

1.5 應用String數據庫分析HSPB6的蛋白相關作用網絡蛋白質之間的功能聯系通常可以從其編碼基因之間的關聯推斷出來：相同功能所需的基因組往往表現出相似性；String數據庫(https://www.string-db.org/)旨在通過整合已知和預測未知的生物體蛋白質間的直接或間接關聯[8]。我們通過String數據庫分析了與HSPB6有相關作用的基因及蛋白，以期預測HSPB6發揮作用的具體機制。

2 結果

2.1 HSPB6在常見腫瘤類型中的表達結果通過Oncomine數據庫的檢索結果可以發現，在人體不同的器官組織中HSPB6的表達水平不同。比較HSPB6在癌組織與正常組織的表達差異后發現，膀胱癌組織中的表達水平明顯低于正常組織。見圖1。

圖1 Oncomine數據庫示HSPB6在常見腫瘤中的表達情況

2.2 HSPB6在膀胱癌組織中的表達我們對涉及HSPB6在膀胱癌組織和正常組織中的表達的4項研究的數據進行了Meta分析，結果發現,與對照組比較, HSPB6基因在所有差異表達基因中的中位數值排名為318.0(P<0.001),提示HSPB6在膀胱癌組織中低表達。見圖2。

2.3 HSPB6在不同膀胱癌研究芯片中的表達差異在Sanchez-Carbayo Bladder 2和Lee Bladder等2項研究中，分別對非浸潤性及浸潤性膀胱癌中HSPB6的表達情況進行了分析，結果均為HSPB6在癌組織中表達水平較正常膀胱組織低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖2 Oncomine數據庫示HSPB6在膀胱癌組織中的表達

圖3 Oncomine數據庫中HSPB6在不同膀胱癌研究芯片中的表達

2.4 HSPB6與膀胱癌患者的生存的關聯我們在GEPIA數據庫中將切點設置為50%，將401例膀胱癌患者分為HSPB6高水平組(n=201)和低水平組(n=201)，并分析其生存預后，結果顯示，HSPB6低水平組的總生存率明顯優于高水平組(HR=12.1，P<0.05)，HSPB6低水平組的疾病無進展生存率明顯優于高水平組(HR=1.8，P<0.05)。見圖4。

2.5 免疫組化檢測示HSPB6在正常膀胱組織與膀胱癌組織中的表達我們利用HPA數據庫分析了正常膀胱組織與膀胱癌組織中HSPB6的免疫組化染色情況，結果顯示：同樣應用CAB001974抗體染色，在3例正常膀胱組織中HSPB6表達強度均為“中”，3例膀胱癌組織中HSPB6表達強度均為“低”；進一步證實了HSPB6在膀胱癌組織中較正常膀胱組織中低表達。見圖5。

圖4 HSPB6表達與膀胱癌預后之間的關系

圖5 免疫組化染色示HSPB6

2.6 HSPB6相關基因的檢測及其功能預測情況我們利用String-DB數據庫檢測了與HSPB6相互作用的蛋白網絡，與HSPB6相關的有HSPB9、HSPA4、HSP90AA1、BAG3、CIZ1、SFN、SHQ1、AKAP13、FN3K、TBC1D21；主要作用機制有與抗凋亡蛋白結合并發揮協同作用、參與DNA復制與功能修復等。見圖6。

3 討論

膀胱尿路上皮癌可分為肌層浸潤型和非肌層浸潤型，非肌層浸潤型的主要治療手段為經尿道電切和術后輔助化療，而肌層浸潤膀胱癌則多采取全膀胱切除治療。膀胱癌細胞集落呈現復雜的異質性，其臨床表現和腫瘤組織形態不一，占非肌層浸潤型絕大多數的乳頭狀癌患者，80%會在治療后的1～2 a內復發。浸潤性膀胱癌患者即使進行根治性的膀胱切除并系統性的放化療后，仍有約50%的患者死于腫瘤轉移[9]。可見，腫瘤的復發、進展及轉移是膀胱癌患者接受治療后面臨的主要風險。傳統的臨床、病理學指標對這些風險的預測能力十分有限。因此，探索與膀胱癌的診療密切相關的指標具有重要臨床意義。

圖6 與HSPB6相互作用的蛋白網絡

HSPs是一組能夠逆轉或抑制細胞蛋白的變性以應對外界壓力或高溫的蛋白；因這些因子在細胞中的生理功能和保護作用，故也被稱為分析伴侶。根據相對分子質量，HSPs大致可分為HSP27、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90和大型HSPs(HSP110和葡萄糖調節蛋白170、GRP170)組[10]。有許多證據表明HSPs與惡性腫瘤的發病機制有關[11]。腫瘤細胞依賴這些蛋白質來適應其微環境，并穩定產生大量支持生長和生存的致癌蛋白質。不同的HSPs家族作為潛在的抗腫瘤靶點被廣泛研究，主要有2個原因:1)HSPs與多種惡性腫瘤相關的通路相互作用，靶向作用于多種致癌通路;2)一些腫瘤通過HSPs來躲避致癌基因產物的傷害[12]。

HSPB6最初是從哺乳動物的肌肉中分離出來的，是HSPB1和HSPB5的部分產物的混合物[13]。HSPB27是在調節惡性腫瘤的發展、進展和轉移以及細胞凋亡和耐藥性中起重要作用的物質，其作用機制主要包括：1)HSP27通過調控p53信號通路抑制細胞衰老[14]；2)HSP27的下調可誘導磷酸酶和腫瘤抑制基因PTEN的表達，表明HSP27負調控PTEN；3)HSP27通過激活腫瘤細胞中的激活蛋白-1來促進細胞增殖[15]；4)HSP27與細胞色素c相互作用，調節其抗凋亡作用；5)C-X-C趨化因子受體1 (CXCR1)觸發惡性腫瘤的發生和發展，CXCR1的缺失可使HSP27的表達下調，提示CXCR1、HSP27與惡性腫瘤的發生有關[16]；6)可溶性環氧化物水解酶抑制劑t-AUCB阻斷HSP27的活化，增加半胱天冬酶-3活性，誘導膠質母細胞瘤細胞凋亡[17]。

在本研究中，我們通過分析TCGA數據庫中的大樣本數據，發現了HSPB6在膀胱癌組織中的表達水平較正常膀胱組織低，但在生存分析中發現HSPB6的高表達卻是膀胱癌患者的不良預后因素，其具體作用機制還未可知。總之，HSPB6可能作為臨床上與膀胱癌的診斷、治療、評估病情相關的重要指標。今后，我們可以從上述可能的作用通路著手做更深一步研究。