潔陰泡騰片質(zhì)量標準研究Δ

楊志潔，姚仲青，朱虹（1.江蘇溧陽市中醫(yī)院，溧陽市 13300；.南京希元生物醫(yī)藥科技有限公司，南京市 10037）

潔陰泡騰片是本院自制制劑，由白鮮皮、地膚子、蛇床子、苦參、黃柏等9味藥組成，具有清熱燥濕、殺蟲止癢的功效。為保證制劑質(zhì)量，筆者對泡騰片的質(zhì)量標準進行了研究。本研究主要采用薄層色譜（TLC）法對制劑中的白鮮皮、苦參、黃柏、花椒、蛇床子分別進行鑒別；采用高效液相色譜（HPLC）法對黃柏的主要活性成分鹽酸小檗堿進行含量測定。結(jié)果表明，所建標準具有專屬性，其方法重現(xiàn)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

LC-10AT型HPLC儀（日本島津公司）；SPD-10AVP型紫外-可見檢測器（日本島津公司）。

潔陰泡騰片（溧陽市中醫(yī)院制劑室，批號：080425、080428、080430）；對照品桐（批號：111700-200501）、苦參堿（批號：805-200005）、鹽酸小檗堿（批號：110713-200609）及對照藥材黃柏（批號：120937-200305）、花椒（批號：121106-200402）、蛇床子（批號：121030-200405）均為中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 白鮮皮的TLC鑒別[1]取本品藥片研細，稱取粉末2 g，加三氯甲烷30 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，得供試品溶液；另取桐對照品，加甲醇1 mL溶解，制成每1 mL含1 mg的溶液，即為桐對照品溶液；再取不含白鮮皮的陰性對照提取物1 g，照供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（10∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點清晰，置365 nm紫外光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。白鮮皮的TLC見圖1。

2.1.2 苦參的TLC鑒別[1，2]取本品藥片研細，稱取粉末0.5 g，加濃氨試液0.5 mL、三氯甲烷25 mL，超聲20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，得供試品溶液；另取苦參堿對照品，加乙醇制成每1 mL含0.2 g的溶液，即得對照品溶液；再取不含苦參的陰性對照提取物0.5 g，照供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。吸取上述3種溶液各4μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-丙酮-甲醇（8∶3∶0.5）為展開劑，展開（展距8 cm），取出，晾干，再以苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1）在10℃以下放置的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干后再展一次，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同橙色的斑點；陰性對照無干擾。苦參的TLC見圖2。

2.1.3 黃柏的TLC鑒別[1，3]取本品藥片研細，稱取粉末0.5 g，加甲醇25 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液即為供試品溶液；另取黃柏對照藥材0.5 g，加三氯甲烷15 mL，超聲20 min，濾過，得對照藥材溶液；另取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，得對照品溶液；再取不含黃柏的陰性對照提取物0.5 g，照供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。吸取上述4種溶液各1μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶6∶1∶1）為展開劑，置氨蒸汽預(yù)飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照無干擾。黃柏的TLC見圖3。

圖1 白鮮皮的TLC1～3.供試品；4.陰性對照；5.桐對照品Fig 1 TLC of D.dasyarpus1～3.test samples；4.negtive control；5.fraxinellon control

圖2 苦參的TLC1.苦參堿對照品；2～4.供試品；5.陰性對照Fig 2 TLC of S.flavescens1.matrine control；2～4.test samples；5.negative control

圖3 黃柏的TLC1.鹽酸小檗堿對照品；2.黃柏對照藥材；3～5.供試品；6.陰性對照Fig 3 TLC of P.chinense1.berberine hydrochloride control；2.Corter Phellodendri；3～5.test samples；6.negative control

2.1.4 花椒的TLC鑒別[1，4]取本品藥片研細，稱取粉末0.5 g，加乙醚10 mL，浸泡過夜，過濾，濾液揮至1 mL，即得供試品溶液；另取花椒對照藥材粉末0.5 g，按上述方法制得對照藥材溶液；再取不含花椒的陰性對照提取物0.5 g，照供試品溶液的制備方法制得陰性對照溶液。吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照無干擾?；ń返腡LC見圖4。

2.1.5 蛇床子的TLC鑒別 取本品藥片研細，稱取粉末1 g，加乙醚15 mL，浸泡10 min，超聲5 min，過濾，濾液揮至1 mL，即得供試品溶液；另取蛇床子對照藥材粉末0.5 g，加三氯甲烷15 mL，超聲20 min，濾過，即得對照藥材溶液；再取不含蛇床子的陰性對照提取物1 g，照供試品溶液的制備方法制得陰性對照溶液。吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯（30∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照無干擾。蛇床子的TLC見圖5。

圖4 花椒的TLC1.花椒對照藥材；2～4.供試品；5.陰性對照Fig 4 TLC of Z.bungeanum1.Pericarpium Zanthoxyli；2～4.test samples；5.negtive control

圖5 蛇床子的TLC1～3.供試品；4.陰性對照；5.蛇床子對照藥材Fig 5 TLC of C.monnieri1～3.test samples；4.negative control；5.Fructus Cnidii

2.2 定量分析[1，5，6]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：C18柱（150 mm×6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（30∶70）；檢測波長：265 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30℃。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取在100℃干燥5 h的鹽酸小檗堿對照品5.2 mg，加甲醇稀釋并定容至25 mL，作為對照品貯備液。精密吸取此貯備液5 mL，以甲醇稀釋至10 mL，即得對照品溶液（0.104 mg·mL-1）。

2.2.3 供試品溶液、陰性對照溶液的制備 取樣品5片，研細，取0.1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；另按處方制得不含黃柏的陰性樣品，同法制得不含黃柏的陰性對照溶液。

2.2.4 陰性對照試驗 分別精密吸取對照品溶液5μL、陰性對照溶液和供試品溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖和峰面積，計算。色譜見圖6。

圖6 高效液相色譜圖A.鹽酸小檗堿對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.鹽酸小檗堿Fig 6 HPLC chromatogramsA.berberine hydrochloride control；B.test sample；C.negative control；1.berberine hydrochloride

由圖6可知，供試品色譜中在與對照品色譜相應(yīng)的位置上有一相同保留時間的色譜峰，而陰性對照在此時間未顯色譜峰，表明在此試驗條件下，其它成分對測定無干擾，方法具有專屬性。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液1、2、3、4、5 mL，置10 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻；分別精密吸取上述各溶液20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖和峰面積。以進樣量（X）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，制備標準曲線，得回歸方程為Y＝4046726.442X+192721.8（r＝0.9978）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿進樣量在0.208～1.04μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液5.0μL，連續(xù)進樣6次。結(jié)果，RSD＝0.56%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取本品0.1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品，于室溫放置。分別在0、1、2、4、6、8 h時測定其中鹽酸小檗堿含量，色譜條件同“2.2.1”，進樣量為20μL。結(jié)果，RSD＝0.86%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重現(xiàn)性試驗 取“2.2.7”項下樣品6份，每份0.1 g，精密稱定，制得供試品溶液。精密吸取供試品溶液20μL、對照品溶液5μL，分別注入色譜儀，測定其中鹽酸小檗堿含量。結(jié)果，平均含量為0.822%，RSD＝0.78%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的本品（含鹽酸小檗堿0.822%）6份，每份0.05 g，精密稱定，分別精密加入鹽酸小檗堿對照品貯備液2.0 mL（0.208 mg·mL-1），加至50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。精密吸取對照品溶液5μL和供試品溶液20μL，分別注入液相色譜儀，測定。結(jié)果，鹽酸小檗堿平均回收率為101.38%，RSD＝1.39%。

2.2.10 樣品含量測定 取3批樣品，測定其中鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果分別為每片8.29、7.93、8.66 mg。

2.2.11 含量限度制訂依據(jù) 根據(jù)處方，每1000片中含主藥黃柏300 g，即每片含黃柏0.3 g。根據(jù)2005年版《中國藥典》（一部）“黃柏”項下規(guī)定，黃柏藥材中的小檗堿含量應(yīng)不低于3.0%，如果100%轉(zhuǎn)移到制劑，應(yīng)含小檗堿9 mg。而實際制備工藝中，小檗堿的轉(zhuǎn)移率為75%～85%。因此，根據(jù)試驗，擬定小檗堿的最低轉(zhuǎn)移率為70%，則制劑中的小檗堿含量應(yīng)不低于每片6.3 mg。3批中試制劑的研究結(jié)果表明，制劑中小檗堿的含量符合要求，由此制定制劑中小檗堿的含量應(yīng)為每片不低于6.3 mg。

3 討論

本制劑處方中白鮮皮清熱燥濕、殺蟲止癢，為主藥，其主要活性成分為白鮮堿、皮酮。但筆者通過預(yù)試驗測定結(jié)果表明，由于皮酮在制劑中的含量極微，測定非常困難，因此選擇了含量相對豐富、測定相對容易的小檗堿進行含量測定；黃柏具清熱燥濕、解毒的功效，小檗堿為其主要活性成分，因此選擇了小檗堿作為含量測定的依據(jù)。文獻報道小檗堿的含量測定方法主要有薄層掃描法[6]、HPLC法[1，5]等方法。筆者采用HPLC法對制劑中所含的主要活性成分小檗堿進行了含量測定研究，結(jié)果表明方法穩(wěn)定、回收率高，且具有專屬性。

本試驗對處方中主要藥味的定性鑒別采用了TLC法，TLC條件參考文獻及《中國藥典》方法，并對所鑒別藥味制備了陰性對照。結(jié)果，供試品斑點清晰，表明方法可行。

綜上所述，本試驗所采用的定性、定量方法簡便、專屬性強，可以作為本制劑的質(zhì)量控制方法。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄31.

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