苜蓿青貯中微生物種群分析及主要菌種的篩選鑒定

馬召穩，李元曉，梁 含，王占彬，李 旺

（河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽 471023）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上栽培面積最大的豆科牧草，再生能力強，抗逆性好，生長速度快，營養豐富，有“飼草之王”的美稱[1]。當前我國苜蓿產品主要以調制青干草為主，但調制干草的過程中因雨淋、落葉等因素使營養成分損失較大[2-3]。青貯是保存青飼料營養物質的有效方法。該方法是一個復雜的微生物區系變化過程，涉及到乳酸菌、腐敗菌、酵母菌、霉菌、芽胞桿菌等多種微生物[4]，這些微生物存在于青貯原料、青貯發酵過程中和發酵完成后等所有時期，并與青貯原料種類和青貯時期有很大關系[5-6]。其中乳酸菌是青貯發酵成功的關鍵微生物[7]。

微生物青貯添加劑可有效縮短青貯飼料制作時間，提升青貯飼料制作的成功率，提高青貯飼料品質。目前主要使用的微生物菌種有乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、片球菌屬(Pediococcus)及部分芽孢桿菌屬(Bacillus)等。研究發現，利用枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和植物乳桿菌(L. plantarum)組合對玉米(Zea mays)進行青貯，制作的青貯飼料品質優良[8]。添加凝結芽孢桿菌(B. coagulans)、植物乳桿菌、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)和乳酸片球菌(P. acidilactici)的全株玉米青貯在感官評價上均優于未添加微生物的自然發酵組[9]。

苜蓿青貯的制作要通過晾曬使水分降至65%左右制成半干青貯或者依靠青貯添加劑[10-13]。苜蓿青貯常用的微生物添加劑為乳酸菌，乳酸菌能夠利用發酵糖分產生乳酸，快速降低其pH，有效抑制霉菌等有害微生物的活動，從而降低青貯飼料養分損失提高青貯飼料發酵品質[2,14]。王麗學等[15]利用5種乳酸菌對紫花苜蓿進行青貯發現，植物乳桿菌和乳酸片球菌能夠顯著提高青貯品質。然而，有研究表明僅添加乳酸菌，能夠降低有氧穩定性[16]，通過添加乳桿菌、地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)及不可培養酸桿菌對苜蓿進行裹包青貯，發現3種菌劑能夠顯著提高苜蓿青貯品質和有氧穩定性[17]。由于青貯原料的差異，導致苜蓿青貯過程微生物種群變化情況存在很多未知。

隨著研究的深入，很多報道從基因水平研究青貯飼料微生物種群組成。徐振上[18]使用16S rDNA宏基因組技術對玉米青貯過程中細菌群落變化進行分析，結果顯示厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteriodetes)三者占據了菌群的95%以上。本研究旨在通過分子生物學技術對苜蓿青貯的微生物菌群進行分析，篩選適合苜蓿青貯的微生物菌種，并對其進行鑒定，開發苜蓿青貯微生物添加劑，改善苜蓿青貯的品質。

1 材料與方法

1.1 材料

苜蓿品種為阿爾岡金(Algonquin)，河南科技大學實驗牧場種植第3年，春季第1茬，初花期刈割后在試驗田晾曬24 h，用于苜蓿青貯制作。

培養基[19]有：MRS培養基[葡萄糖4 g，胰蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，牛肉膏2 g，MnSO4·4H2O 0.007 6 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，Tween-80 0.2 mL，K2HPO40.4 g，檸檬酸胺0.4 g (固體培養基加瓊脂粉3.2 g)，無菌水200 mL，pH 6.2～6.4]；LB培養基[胰蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，氯化鈉2 g (固體培養基加瓊脂粉3.2 g)，無菌水200 mL，pH 7.0～7.2]；NA培養基[牛肉膏0.6 g，蛋白胨2 g，氯化鈉1 g，無菌水200 mL (固體培養基加瓊脂粉3.2 g)，pH 7.2]；PDA培養基[去皮馬鈴薯40 g，加入200 mL無菌水煮沸20 min，雙層紗布過濾后補充水至200 mL，加入葡萄糖4 g (固體培養基加瓊脂粉3.2 g)，121 ℃高壓滅菌20 min，用乙醇溶解0.02 g氯霉素，加入培養基中]；麥氏培養基[葡萄糖0.2 g，氯化鉀0.36 g，酵母粉0.5 g，乙酸鈉1.64 g (固體培養基加瓊脂粉3.2 g)，蒸餾水200 mL]。

主要試劑：細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，生化試劑購自TAKARA生物公司，其他化學試劑均為分析純，購自洛陽博冠商貿有限公司。

采用通用引物[20]，上游：5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAC-3′，下游：5′-AAGGAGGTGATCCAG CC-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 苜蓿青貯的制作

將刈割的紫花苜蓿晾曬至水分含量為65%左右時，用剪刀剪成1 cm長的小段，裝入500 mL廣口瓶中，壓實密封，厭氧發酵，制作3瓶，每瓶為1個重復。

1.2.2 苜蓿青貯品質評定[21]

青貯第60天取樣，3個重復取樣后混合均勻，由具有青貯飼料質量評估經驗的3人做現場感官評分，評定標準參考《德國DLG青貯飼料感觀評分標準》[22]分為優(20～16分)、良(15～10分)、中(9～5分)和下(4～0分) 4個等級。評分內容為嗅覺、結構和色澤：嗅覺分5個等級(0～14分)；結構分4個等級(0～4分)；色澤分3個等級(0～2分)。

1.2.3 苜蓿青貯樣品宏基因組測序分析

由美因健康科技(北京)有限公司協助完成。

細菌基因組DNA的提取與質量檢測：將苜蓿青貯3個重復各取3 g樣品混合均勻，按照細菌基因組提取試劑盒說明進行苜蓿青貯中細菌全基因組DNA的提取，利用Nanodrop檢測DNA的純度和濃度，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，然后利用Qubit3.0對DNA濃度進行精確定量。

宏基因組文庫的構建及質量檢測：使用Covaris超聲波破碎儀進行隨機打斷，選取合適長度的片段，經過末端修復、3′端加A、加接頭、純化、擴增等完成宏基因組文庫制備，文庫的質量檢測為：用Qubit3.0對文庫初步定量并稀釋至1 ng·μL-1→Qsep100對文庫的Insert Size檢測→利用Q-PCR對文庫有效濃度進行準確定量。宏基因組文庫質檢合格后按照有效濃度和目標下機數據量進行上機測序，測序策略為Illumina Hiseq，PE150。

測序完成后，對原始下機數據進行質量控制(Raw Data)、拼接組裝、基因預測并構建非冗余基因集(gene catalogue)，然后對得到的基因進行物種和功能上的注釋、分類以及豐度統計，在上述分析的基礎之上，對樣品或樣品組間進行相似聚類，分組排序，差異比較等多方向的統計分析，并對結果進行可視化展示。

1.2.4 微生物菌種的篩選

微生物的篩選方法參考文獻[7]的操作方法作進一步優化調整。在超凈臺中將10 g青貯樣品剪碎后放入90 mL無菌水混合于150 mL三角瓶中，封口膜封口，置于搖床上震蕩30 min，配置1 × 10-2、1 × 10-3、1 × 10-4共3種稀釋梯度，取50 μL稀釋液滴在MRS、NA、LB、PDA以及麥氏培養基上，用涂布棒將菌液在培養基上涂抹均勻，然后將培養基倒轉靜置20～30 min，將MRS和麥氏培養基在37 ℃厭氧、NA、LB、PDA在37 ℃有氧條件下培養24～48 h，分離微生物。

1.2.5 微生物菌株的鑒定

形態學鑒定：對所篩菌種進行純培養，分別在不同的固體培養基上，觀察菌落的形態、顏色、大小、光澤等菌落特征，用接種環分別挑取單菌落，進行革蘭氏染色[23]，顯微鏡下觀察菌體顏色、大小、形狀、是否有芽孢等菌體特征。

分子生物學鑒定：參照細菌基因組提取試劑盒說明書，提取所篩菌種基因組DNA，擴增菌種的16S rDNA保守序列。對擴增產物進行測序，并通過NCBI Blast N進行保守序列的分析比對。PCR擴增體系為25 uL體系，包括：① 10 × Ex Taq buffer：2.5 μL，② dNTP：2 μL，③ 上游引物：1 μL，④ 下游 引物：1 μL，⑤ Ex Taq酶：0.5 μL，⑥ 模板(基因組DNA)：1 μL，⑦ ddH2O：17 μL。PCR反應條件及程序為：預變性94 ℃ 2 min→35個循環(變性94 ℃30 s→復性57 ℃ 30 s→延伸72 ℃ 1 min30 s)→終延伸72 ℃ 10 min→4 ℃保存。

2 結果與分析

2.1 苜蓿青貯質量評定

對所制作的苜蓿青貯樣品進行品質評定，氣味評分10.78，結構評分3.22，色澤評分1.56，綜合評分15.56，結果顯示，青貯品質評定等級為良好。

2.2 苜蓿青貯中微生物種群分析

2.2.1 宏基因組文庫基因信息分析

通過構建宏基因組文庫，從苜蓿青貯樣品中篩選和組裝了60 710個基因樣品，通過測序得知這些基因總長度為39 948 615 bp，平均長度為720.04 bp，對其進行了編號并計算了基因豐度信息。將這些基 因 在Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數據庫與Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy)數據庫中進行BLAST(balst p)比對分析和功能注釋；經過分析苜蓿青貯宏基因組中的基因主要涵蓋6大功能類：糖苷水解酶(glycoside hydrolases，GHs)、糖 基 轉 移 酶(glycosyl transferases，GTs)、多糖裂合酶(polysaccharide lyases，PLs)、碳水化合物酯 酶(carbohydrate esterases，CEs)、輔 助 氧 化 還 原酶(auxiliary activities，AAs)和碳水化合物結合模塊(carbohydrate-binding modules，CBMs)。

2.2.2 宏基因組文庫物種信息分析

圖 1 苜蓿青貯中微生物菌種群落分析Figure 1 Analysis of microbial communities in alfalfa silage

利用宏基因組測序技術擴增苜蓿青貯中微生物保守序列，并對基因豐度在0.1%以上的基因序列進行相似性分析和比對(圖1)。可以看出，相似性大于95%水平上的微生物物種共有53 587個，分屬18個門，28個綱，59個目，87個科，207個屬，672個微生物物種。厚壁菌門物種基因豐度可達99.4%，為主要優勢微生物群落。序列測定基于目水平的分析，微生物群落數為51 822個，主要以芽孢桿菌目(Bacillales)和乳酸菌目(Lactobacillales)為主，分別占到目水平微生物群落總數的64.5%和18.9%。基于屬的水平可分析，微生物群落總數為43 502個，其主要微生物群落為海洋桿菌屬(oceanobacillus)、乳桿菌屬(Lactobacilli)、芽孢桿菌屬(Bacilli)、枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)、乳酸球菌屬(Lactococcus)以及部分梭菌屬(clostridium)等。其所占比例分別達到了24.9%、14.3%、13.9%、13.2%、5.8%、4.1%。

在種的水平對苜蓿青貯微生物菌種分析，結果顯示芽孢桿菌菌種所占的比例較大，主要有枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、阿氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai)，短小芽孢桿菌(B. pumilus)以及尚未鑒定到種的部分芽孢桿菌屬菌株(Bacillussp.)。海洋桿菌屬的微生物菌種主要為O. damuensis及未鑒定到種的部分Oceanobacillussp.菌株。乳桿菌屬微生物菌種主要有植物乳桿菌及短乳桿菌(L. brevis)等。乳酸球菌屬的微生物菌種主要為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和乳酸片球菌。腸球菌屬的菌株主要是糞腸球菌(E. faecalis)和屎腸球菌(E. faecium)。枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)的菌種主要為V. pantothenticus、V. halodenitrificans以及V. alimentarius等。

2.3 苜蓿青貯主要微生物菌種的篩選

利用MRS培養基厭氧培養的方式從苜蓿青貯中共篩選出13株菌株，暫命名為MRS1、MRS2、MRS3、MRS4、MRS5、MRS6、MRS7、MRS8、MRS9、MRS10、MRS11、MRS12、MRS13；利用麥氏培養基厭氧培養方式篩選出3株菌株，暫命名為MC1、MC2、MC3；PDA培養基好氧培養篩選出8株菌株，暫命名為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8；利用NA培養基和LB培養基好氧培養分別從苜蓿青貯中篩選出2株和4株菌株，暫命名為NA1、NA3和LB2、LB5、LB6、LB7。

2.4 菌株的形態學鑒定

2.4.1 菌株的菌落特征鑒定結果

從苜蓿青貯中分離出的菌株MRS1～13、MC1～3及NA1的菌落特征為圓形、邊緣整齊、表面光滑、中央凸起的乳白色單菌落(圖2A)。菌株P5、P8、LB2、LB5、LB6菌落表面不光滑，邊緣不整齊，中部有突起的皺褶(圖2B)。菌株P1～P4、P6、P7、LB7和NA3的菌落呈白色，邊緣不整齊，表面不光滑，有突起的皺褶(圖2C)。

2.4.2 菌株的菌體特征鑒定結果

從苜蓿青貯中分離出的菌株MRS1～9、MRS11、MRS12、MRS13、以及MC1、MC2、MC3革蘭氏染色結果為革蘭氏陽性，短桿狀，單個或呈鏈狀排列(圖3A)。MRS10和NA1革蘭氏染色呈球形，單個或鏈狀排列的革蘭氏陽性菌(圖3B)。菌株PDA1～8、LB7和NA3革蘭氏染色結果為革蘭氏陽性、桿狀、單個或短鏈狀排列，芽孢中生或端生(圖3C)。

圖 2 苜蓿青貯中的部分菌株菌落特征Figure 2 Bacterial colonies in alfalfa silage

圖 3 苜蓿青貯中篩選出的部分菌株菌體Figure 3 Strains isolated from alfalfa silage

2.5 分子生物學鑒定

提取篩選到的微生物的基因組DNA，以每個菌種基因組DNA為模板，以細菌16S rDNA序列通用引物對其保守序列進行擴增(圖4)。可以看出，所篩菌種均成功擴增出大小約1 500 bp左右的DNA片段。對擴增片段進行序列測定，將序列測定結果經NCBI Blast N進行序列比對發現菌株MRS1～MRS9和MRS11～MRS13以及MC1～MC3與植物乳桿菌(MG551233.1)的相似度達到了99.8%；菌株MRS10與乳酸片球菌菌株(KY550661.1)的相似度達到98.42%；菌株NA1與糞腸球菌(CP028727.1)的相似度達到了98.80%；菌株LB6與阿氏芽孢桿菌(KU052707.1)的相似度達到了99.44%；菌株P1～P4、P6、P7、LB7、NA3與枯草芽孢桿菌菌株(KC422328.1)相似度達到99.58%；菌株LB5、P5與地衣芽孢桿菌菌株(CP035404.1)的相似度達到了99.92%；菌株P8與短小芽孢桿菌菌株(KC692158.1)的相似度達到了99.55%。菌株LB2與解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)菌株(CP029071.1)的相似度達到了99.63%。結合形態學鑒定，初步確定從苜蓿青貯樣品中篩選到植物乳桿菌15株，乳酸片球菌和糞腸球菌各1株，各種芽孢桿菌12株。說明苜蓿青貯樣品中的微生物菌種以乳酸菌和芽孢桿菌為主。

3 討論與結論

本研究采用宏基因組測序技術對苜蓿青貯中微生物菌落進行分析，結果顯示，厚壁菌門微生物的基因豐度高達99.4%，其中海洋桿菌屬、乳酸桿菌屬以及芽孢桿菌屬等基因豐度較大，與徐振上[18]在青貯玉米中微生物菌群分布的研究結果相似。但本研究在屬的水平分析的微生物物種與已有報道差異較大，可能的原因是青貯原料差別所引起，也可能與樣品開封后在氧氣中暴露的程度有關[6,24]。

在青貯飼料菌種篩選上，有報道從青貯玉米及苜蓿青貯中篩選出不同的微生物菌種。李旭嬌和玉柱[25]利用傳統微生物培養方法從苜蓿青貯飼料中篩選到4株植物乳桿菌。韓吉雨[26]通過對青貯發酵體系中乳酸菌多樣性的研究發現，玉米青貯飼料在發酵第60天時篩選出的微生物有植物乳桿菌。張慧杰等[27]從阿爾岡金和敖漢兩個品種的紫花苜蓿青貯飼料中篩選到了乳酸片球菌。韓吉雨[26]篩選出的與乳酸片球菌特征一致的菌種，說明乳酸片球菌是苜蓿青貯的另一個主要菌種。除了乳酸菌之外，張濤[28]、席琳喬等[29]分別在苜蓿青貯和青貯玉米中篩選到地衣芽孢桿菌的近緣菌種。芽孢桿菌能夠產生具有抑制酵母和霉菌的細菌素，能夠顯著提高青貯飼料的有氧穩定性[30]，并參與青貯飼料的整個發酵過程。

本研究篩選到植物乳桿菌15株，乳酸片球菌和糞腸球菌各1株，各種芽孢桿菌12株。與已有報道結果基本一致，說明乳酸菌和芽孢桿菌是青貯飼料的主要微生物菌種[25,28]。傳統微生物篩選方法不能完全獲得青貯飼料微生物種群的信息。本研究通過宏基因組測序分析了苜蓿青貯中的主要微生物類群，并通過配制相應的培養基篩選到主要的微生物菌種，對微生物種屬的鑒定結果與宏基因組測序分析結果相一致。說明宏基因組測序技術能夠有效分析苜蓿青貯樣品中的微生物組成和種群信息，為篩選和使用苜蓿青貯中的微生物提供很大幫助。